研究背景纯钛及钛合金是目前口腔种植医学领域中应用最广泛的金属材料,具有稳定的化学性能,良好的生物相容性及机械加工性能,但其同时存在与骨结合强度低、愈合时间长及金属离子释放等问题,较大地影响了临床种植的成功率。近年来,随着口腔种植医学的快速发展,研究者利用各种方法对纯钛进行表面改性,以期获得良好的种植体—骨生物界面从而增强骨结合强度,也成为当今研究的热点之一。微弧氧化(Micro-arc Oxidation,MAO)是阳极氧化技术的一种,20世纪30年代初期,Gunterschulze和Betz第一次报道了在高电场下浸在液体里面的金属表面出现火花并放电的现象,利用此现象也可以制成氧化膜,并应用在镁合金防腐方面。20世纪末开始微弧氧化技术被应用于口腔种植体的表面处理方面,它直接在有色金属表面原位生长陶瓷层,突破了阳极氧化对电压的限制,使得钛基体经处理后不仅提高了耐磨损性能、耐腐蚀性能,还同时生成均匀多孔的二氧化钛薄膜层,并且富含钙、磷元素,利于诱导成骨,显著地提高了纯钛种植体的生物活性和骨传导性,对促进种植体与骨组织的早期结合,提高结合强度具有重要意义。然而在微弧氧化过程中,同时存在化学氧化、电化学氧化、等离子体氧化现象,其反应体系复杂而且未能统一电参数；同时,微弧氧化处理后的纯钛种植体,作为骨组织工程生物材料,不仅要求其表面成分、结构、形态、亲疏水性等特性能对材料-组织间相互作用产生影响,同时细胞必须首先在材料上发生适当的粘附,才可能进一步增殖、迁移、分化,细胞与材料间良好的粘附作用对于组织再生和植入物的修复起重要作用。由于研究时间较短,对微弧氧化后的种植体材料表面特性研究不够深入。目前,已知的电参数中,电压、电流密度、占空比、频率、反应时间、电解质浓度等均对微弧氧化产生一定的影响。本实验中,仅选取占空比、电压、电解质浓度三个参数作为主要研究对象,讨论其对微弧氧化后纯钛表面特性的影响后,希望得到较为合适的电化学参数；进一步初步探讨了不同浓度的电解质处理之后的纯钛表面特性,及其对成骨细胞的粘附、增殖、生长分化的不同影响,寻求其中的规律,为优化微弧氧化种植体表面处理技术提供理论依据。目的1.初步研究比较了不同占空比、电压、电解质浓度对微弧氧化纯钛表面特性的影响,得出生成较好性能的微弧氧化纯钛膜层表面的电参数；2.根据初步研究结果,选定合适占空比、电压,在不同浓度电解质下形成微弧氧化纯钛,进一步研究其膜层特性,比较其对人成骨肉瘤细胞系MG-63粘附、增殖、分化的不同影响,为微弧氧化种植体处理技术的优化提供理论依据。材料和方法材料准备：将工业纯钛加工成为直径为15mm、厚度为1.2mm纯钛圆片试件,用200～800碳化硅砂纸逐级打磨,分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声荡洗10min。1、研究不同占空比、电压、电解质浓度对微弧氧化纯钛表面特性的影响(1)分组：1)占空比组：在占空比分别为5%、25%、45%、65%的条件下对钛片进行微弧氧化处理,其余处理因素恒定。所得钛片依次对应为a、b、c、d四组；2)电压组：在电压分别为250V、300V、350V、400V的条件对钛片进行微弧氧化处理,其余处理因素恒定。所得钛片对应为a、b、c、d四组；3)电解质浓度组：在电解质钙磷浓度比分别为0.12、0.16、0.20的条件下对钛片进行微弧氧化处理,其余处理因素恒定。所得钛片对应为a、b、c三组。(2)方法：使用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy SEM)观察各组钛片表面微形貌,X射线能谱仪(Energy Dispersive X-ray spectroscopy EDS)检测钛片表面相对元素含量,X射线衍射仪(X-ray Diffraction XRD)检测钛片表面晶相结构。2.进一步研究不同电解质浓度处理后微弧氧化纯钛特性,及其对人成骨肉瘤细胞MG-63形态、粘附、增殖、分化的影响(1)分组：将钛片分为A、B、C、D四组,光滑钛片组设为A组,电解质钙磷浓度比为0.12、0.16、0.20的条件下,处理钛片分别对应为B、C、D三组。(2)方法：1)表面轮廓仪测量四组钛片表面粗糙度,观察其表面形貌；OCA40视频光学接触角测量仪测量钛片表面动态水接触角,并进行统计学分析比较。2)细胞形态学观察及粘附率计算：将人成骨肉瘤细胞MG-63以1×104/cm2的浓度分别接种于四组钛片处理表面,每孔加入10%FBS和1%双抗的低糖DMEM培养液1.0m1,在37℃饱和湿度、5%CO2的恒温孵箱中密闭培养,48小时换液。接种后将1h、3h、6h及24h的钛片取出并进行处理,使用SEM观察细胞在各个时间段在钛片表面的形态变化情况及其与钛片的粘附关系；另将接种后将1h、3h、6h及24h的钛片取出进细胞肌动蛋白直接免疫荧光染色,使用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)观察细胞肌动蛋白的变化；对1h、3h及6h三个时间段通过荧光染核摄片,然后计算钛片上细胞粘附率并进行统计学分析比较。3)细胞增殖活性及分化水平的研究：将人成骨肉瘤细胞MG-63接种于A、B、C、D四组钛片表面,接种浓度及方法同前,接种后1d、4d及7d的细胞采用MTS法测其OD值,比较四组钛片上细胞不同时间段的增殖活性；将接种于钛片7d和14d后的细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测,比较四组钛片上成骨肉瘤细胞ALP的分化水平。4)以上每个处理组每个时间点均设6个样本量,统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析,多个样本均采用单因素方差分析(One-way ANOVA),Levene’ test检验方差是否齐性,方差齐则采用LSD样本均数间的两两比较,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行方差分析后,Dunnett’s T3多重比较。实验结果1.不同占空比、电压、电解质浓度处理后微弧氧化纯钛表面均粗糙多孔,似火山口状；主要含有Ca、P、O、Ti四种元素；晶相结构主要为金红石型TiO2和锐钛矿型TiO2。具体如下：(1)占空比：1)a组：表面孔径约为1～3μm大小；钙磷元素含量比值为0.91；晶相主要为锐钛矿型TiO2,未见金红石型Ti02；2)b组：表面孔径约为1～5μm大小；钙磷元素含量比值为1.18；晶相主要为锐钛矿型TiO2,可见少量金红石型TiO2；3)c组：表面孔径约为1～8μm大小,微孔密度减小,可见部分区域有裂纹产生；钙磷元素含量比值为1.25；晶相主要为锐钛矿型TiO2,金红石型TiO2较少：4)d组：表面孔径约为1～10μm大小,单位面积内微孔数目减少,可见明显表面裂纹；钙磷元素含量比值为1.46；晶相主要为锐钛矿型TiO2,金红石型TiO2有少量增加。(2)电压：1)a组：表面孔径约为1～3μm大小；钙磷元素含量比值为1.14;晶相主要为锐钛矿型TiO2,未见金红石型TiO2；2)b组：表面孔径约为1～5μm大小；钙磷元素含量比值为1.18；晶相主要为锐钛矿型TiO2,可见少量金红石型TiO2衍射峰；3)c组：表面孔径约为1～5μm大小,微孔密度减小,表面部分区域有裂纹产生；钙磷元素含量比值为1.23；晶相主要为锐钛矿型TiO2,金红石型TiO2增加明显；4)d组：表面孔径约为1～10μm大小,单位面积内微孔数目减少,可见明显表面裂纹；钙磷元素含量比值为1.47；晶相主要为锐钛矿型TiO2,金红石型TiO2增加。(3)电解质浓度：1)a组：表面孔径约为1～5μm大小；钙磷元素含量比值为1.17；晶相主要为锐钛矿型TiO2,可见少量金红石型TiO2；2)b组：表面孔径约为1～8μm大小；钙磷元素含量比值为1.53；晶相主要为锐钛矿型TiO2,可见部分金红石型TiO2；3)c组：表面孔径约为1～10μm大小,微孔密度减小,有表面裂纹产生；钙磷元素含量比值为1.77；晶相主要为锐钛矿型TiO2及金红石型TiO2。2.不同电解质浓度处理后微弧氧化纯钛表面特性,及其对人成骨肉瘤细胞MG-63形态、粘附、增殖、分化的影响：(1)表面形貌轮廓仪观测,结果四组钛片呈现出各自的表面形貌特征。A组光滑钛片表面形貌较为均一,无明显高低不平；B、C、D三组均存在不同程度的高度差异。粗糙度检测结果显示A<B<C<D；静态水接触角测得：A>C、D>B,C、D组间差异无统计学意义。(2)细胞形态学观察及粘附率计算：1)扫描电镜观察：1h时粘附于四组钛片上的细胞均小而圆；3h时细胞表面积增加,6h时,24h时表面细胞铺展开来,铺盖微弧氧化表面数个粗糙小孔；光滑钛片组表面细胞较为平铺,B、C、D组钛片表面细胞伸出伪足,附着于膜层表面的孔洞边缘甚至于向孔洞内部延伸,铺盖于钛片表面凹凸不平之处。2)激光共聚焦显微镜观察：四组钛片上接种1h后的细胞肌动蛋白呈环状,包裹细胞核周围；3h时,四组钛片上细胞肌动蛋白更加明显, B、C、D组可见微丝束呈车轮状向四周放射；6h、24h时A组光滑钛片上微丝呈现长梭形,而微弧氧化B、C、D三组呈现典型多边形,尤其是D组,多向分化更加明显。3)细胞粘附率：细胞接种1h时,A组细胞粘附率最低,其次是B组,C、D间差异无统计学意义；3h时,细胞粘附率A<B<C、D,C、D组间差异无统计学意义组；细胞粘附6h时,方差分析得整体比较四组间无统计学差异。2.细胞增殖活性及分化水平的研究：(1)MTS法比较四组的细胞增殖水平：细胞接种1d,四组钛片结果中,A、C、D三组之间统计学差异无意义,B组增殖活性较A组高；4d时,C、D两组增殖率大于A组,而C、D两组间差别无统计学意义；7d时,D组增殖活性最大,与A、C、B三组之间差异有统计学意义。(2)成骨细胞ALP分化水平：7d时,四组钛片ALP活性经分析后具有统计学意义,D组高于其余四组；14d时,C、D组表面细胞ALP分化水平均高于A、B组,A、B组间及C、D组间差异无统计学意义。结论1。占空比、电压、电解质浓度增加,纯钛氧化层表面微孔尺寸增大,微孔密度减少且裂纹越明显；膜层表面Ca/P比值增大；膜层中金红石型Ti02衍射峰逐渐增加。其中：(1)占空比为25%左右时,钛片表面未见裂纹,且同时含有金红石型Ti02和锐钛矿型TiO2,可作为较为合适的电参数。(2)电压为300V左右时,钛片氧化层Ca/P比值接近较高电压的c组,且其表面并未见裂纹,同时含有金红石型Ti02和锐钛矿型Ti02,可作为较为合适的电参数。(3)钙磷电解质浓度比为0.16时,钛片氧化层Ca/P比值较大,表面并未见明显裂纹,金红石型TiO2增加明显,可作为实验参考。2。不同电解质浓度处理后微弧氧化纯钛特性,及其对人成骨肉瘤细胞MG-63形态、粘附、增殖、分化的影响：(1)微弧氧化处理后,钛片粗糙度增加,表面润湿性增加。电解质浓度越大,钛片粗糙度值越大,其中B组润湿性能最好,说明并不是粗糙度愈大,润湿性就愈好。(2)细胞粘附随着时间发展在材料表面出现规律性的变化；具有一定粗化程度及表面润湿性的材料表面,更适合细胞粘附伸展。各组细胞粘附率性随着时间增加而增加,细胞粘附1h、3h时,粗糙度较高的C、D组钛片较光滑组更利于细胞的粘附。(3)各组细胞增殖活性及ALP分化水平随着时间增加而增大,粗糙度最高的D组增殖活性最强,C组次之；C、D两组ALP分化水平高于A、B两组,利于细胞粘附的表面也利于细胞增殖分化。总结以上研究结论,占空比为25%,电压为300V,电解液钙磷浓度比为0.16时,可以获得较好的纯钛表面形貌,较高的钙磷含量比值,同时含有金红石型TiO2和锐钛矿型TiO2,增加了钛片表面粗糙度及润湿性,也促进人成骨肉癌细胞MG-63在其表面的粘附、增殖与分化。