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中介蝮(Gloudius intermedius)为蝰科蝮亚科(Crotalinae)毒蛇,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,广泛分布于我国西北、华北地区。其PLA2神经毒素为蛇毒中活性最强的组分,具有潜在的利用价值,但是其功能及作用机制不明,这妨碍了对其PLA2的利用及蛇伤保护。用传统的层析法制备方法从蛇粗毒中分离得到PLA2,但受到天然蛇毒资源量的限制,无法满足研究方面的需求。因此使用基因工程技术来表达获得svPLA2成为合适的选择。然而,在原核表达体系中,由于离开毒腺细胞的天然环境,缺乏蛋白折叠所需要的一些辅助因子,使得蛇毒蛋白在原核表达后常形成无活性的包涵体而归于失败。本研究一方面在37℃下对融合蛋白进行诱导表达,纯化后得到包涵体,对其进行复性研究；另一方面通过低温诱导,得到可溶性表达产物,并对其活性进行测定。研究内容及方法：(1)DsbA2.0-GI1和DsbA2.0-GI2蛋白的表达纯化与复性：37℃下,培养含pET-DsbA2.0-GI1和pET-DsbA2.0-GI2重组质粒的Rosetta-gami(DE3)pLysS工程菌,OD600为0.4-0.6时,加入IPTG诱导(浓度为1mmol/L),诱导5小时后,收集菌体,裂解,Ni2+-IDA resin亲和层析法纯化包涵体。采用稀释复性和透析复性的方法对纯化得到的包涵体蛋白进行复性,在复性过程中通过添加不同的添加剂,研究添加剂对复性的影响,复性后通过测定其可溶性的含量计算复性率。将复性蛋白的标签切除,优化出最佳的酶切条件,并对酶切后的蛋白进行固体琼脂板卵磷脂透明圈法、卵磷脂红细胞裂解法以及对革兰氏阴性菌—大肠杆菌的抑菌效应。(2)融合蛋白DsbA2.0-GI1和DsbA2.0-GI2的低温诱导表达：首先优化诱导温度和时间,在25℃、18℃下分别诱导Id、2d、3d、4d,通过SDS-PAGE检测从而得出最佳温度和时间。最后在优化好的最佳时间及温度下进行大规模诱导,离心收集菌体后,超生破碎后,从上清中纯化出目标蛋白,纯化后的蛋白用凝血酶切除融合标签后,用琼脂板卵磷脂透明圈法、红细胞裂解法检测PLA2活性,并检测了所表达蛋白对大肠杆菌的抑菌效应。结果：(1)采用稀释复性和透析复性对包涵体进行复性,发现在复性过程中添加L-精氨酸,GSH/GSSH,以及Ca2+可以有效促进包涵体复性,优化得到的包涵体最佳复性体系为：100mmol/L Tris-HCl (pH8.0),0.15 mol/L NaCl, 1mmol/L EDTA,0.5 mol/L L-Arg,0.1 mmol/L GSSG/0.5 mmol/L GSH,2 mmol/L CaCl2。DsbA2.0-GI1和DsbA2.0-G12稀释复性后复性率分别达到29.7%和32.6%,透析复性后复性率分别达到36.4%、32.5%。(2)凝血酶切除融合蛋白标签的最佳条件为：16℃、12小时。(3)以中介蝮粗毒做阳性对照,卵磷脂琼脂平板法检测了DsbA2.0-GI1、DsbA2.0-GI2组分的PLA2酶活性很小；红细胞血红蛋白释放法测定了毒素的溶血活性,发现DsbA2.0-GI1、DsbA2.0-GI2组分可以引起溶血,但活性比粗毒低。以大肠杆菌为对象,粗毒为阳性对照,PBS为阴性对照,检测DsbA2.0-GI1、DsbA2.0-GI2的24h抑菌效应,粗毒组出现的抑菌圈明显,而DsbA2.0-GI1和DsbA2.0-GI2的抑菌活性不高。(4)低温诱导发现,在18℃下诱导4d时,目的蛋白以可溶性形式高水平表达,Ni2+-IDA resin亲和层析纯化后,凝血酶酶切(16℃,12小时)处理,目的蛋白DsbA2.0-GI1和DsbA2.0-GI2均有很小的酶活性和溶血活性,但是均未出现抑菌活性。结论：在最佳复性条件下,稀释复性DsbA2.0-GI1和DsbA2.0-GI2的复性率分别达到29.7%、32.6%,透析复性的复性率达到36.4%、32.5%；18℃下低温诱导4d,可以获得有活性的可溶性PLA2蛋白,为将来在原核表达系统中获得有活性的PLA2提供一种思路。