揭示长期不同施肥制度对稻田土壤微生物的影响,为农田优化施肥和耕作制度提供理论依据。采用Illumina MiSeq高通量测序平台和荧光定量PCR技术,研究湖南省双季稻区连续8年不施肥（CK）以及冬种紫云英不还田条件下3种氮肥水平（N200、N100、N0）对紫云英盛花期土壤微生物群落数量和结构的影响。结果表明,与CK相比,冬种紫云英不还田配施氮肥显著降低土壤pH、硝态氮及土壤碳氮比（C/N）,显著提高稻田土壤全氮、全碳和铵态氮。稻田土壤微生物数量在1.66×10⁸～1.23×10¹⁰拷贝数·g^-1干土,施肥均增加16S rDNA基因丰度,N200、N100、N0三种施肥处理的16S rDNA基因拷贝数分别是CK的32.6、74.4、1.0倍。3种氮肥水平处理的多样性指数（香农指数与辛普森指数）以及物种丰富度指数（Ace与Chao1）均高于CK,其中多样性指数最高的是N200,物种丰富度最高的是N100。不同样品16S rDNA的门水平分类的3个主要类群是变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）,分别占总OTU比例的33%～44.4%、17%～22.3%和9%～10%;N200、N100和N0土壤样品中变形菌门（Proteobacteria）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度均低于CK,而N200、N100和N0土壤样品中绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度分别是CK的1.2、1.3和1.2倍。相关性分析表明,细菌16S rDNA基因拷贝数与土壤总碳、土壤总氮和铵态氮显著相关;土壤细菌菌群与多数土壤化学指标间存在密切的相关性。综上,冬种紫云英不还田施氮肥显著增加水稻产量和紫云英盛花期土壤微生物数量,改变土壤微生物菌群结构,改善了土壤化学性质,对湖南双季稻区科学合理种植绿肥具有指导的意义。