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研究背景及意义成体干细胞源肝细胞为肝病的治疗提供了新思路,其中种子细胞的获得和肝功能重塑是关键环节。目前对于不同成体干细胞成功诱导功能性肝细胞的报道很多,但诱导的低效性大大限制了其临床应用。小涎腺同属消化道腺体,具有来源广泛,取材方便与供区损伤小的优点,是非常理想的成体干细胞来源,具有巨大的研究价值和应用潜力。此外,我课题组进行人小涎腺干细胞研究时发现,人小涎腺间充质干细胞(hMSG-MSCs)表达较多肝细胞相关蛋白,提示hMSG-MSCs可能成为体外快速获得功能性肝细胞的种子细胞。利用人小涎腺间充质干细胞进行快速体外成肝诱导,将为肝病细胞治疗提供理论基础和技术支持。目的1.从人小涎腺组织分离获得间充质干细胞,对hMSG-MSCs进行鉴定,为体外快速成肝诱导做干细胞源基础。2.对hMSG-MSCs进行快速体外成肝诱导,并鉴定诱导细胞相关基因和蛋白表型,检测最终诱导获得细胞是否具有成熟肝脏细胞相关功能。方法1.对人小涎腺组织进行原代培养,从中分离培养出间充质干细胞,体外传代扩增。利用流式细胞仪对获得细胞进行表型鉴定,并进行成骨成脂分化诱导。2.在体外二维培养环境下,通过三步法利用CHIR99021、HGF、FGF4、EGF等细胞诱导因子对hMSG-MSCs进行快速成肝诱导,观察诱导过程中细胞状态及形态变化,利用Real-time PCR及免疫荧光检测诱导细胞相关表型的表达,并通过PAS染色和ICG摄取检测最终诱导获得细胞相关成熟肝脏细胞功能。结果1.从人小涎腺组织块中成功分离培养获得hMSG-MSCs,该细胞呈纺锤样(长梭形),体外增殖迅速,且其细胞特性保存完整。细胞流式分析表明,获得的hMSG-MSCs表达CD29、CD90和CD166等间充质干细胞标记物,不表达CD117、CD45等造血干细胞标记,也不表达CD49f等上皮类细胞标记,并且可成功向骨、脂肪方向进行分化。2.在体外二维培养环境下,三步法hMSG-MSCs体外成肝诱导共用时6天。诱导第一天后,80%-90%的细胞形态由长梭形变为短梭形;第二天后细胞形态变为多角形,第六天后最终变为类肝细胞形态。Real-time PCR显示,内胚系祖细胞标志物F0XA2、S0X17及新生肝细胞标志物AFP先升高后降低,成熟肝细胞标志物ALB、CYP3A4和AAT持续升高。免疫荧光检测不同阶段相关蛋白阳性表达。ICG摄取和PAS染色均为阳性。结论1.由人小涎腺组织可分离培养获得hMSG-MSCs,该细胞具有强大自我更新能力和多向分化潜能,可以作为体外快速成肝诱导的种子细胞。2..hMSG-MSCs在体外二维培养环境下通过三步法6天成肝诱导,最终所获得的细胞为成熟且具有一定功能的肝细胞。