近年来,新发传染病(emerging infectious diseases,EID)的频繁发生严重威胁着人类的健康和社会安定,据不完全统计超过60%的新发传染病是来源于动物源性。蝙蝠作为世界上仅次于啮齿类动物的第二大类哺乳动物,在众多重要人兽共患病的发生,流行和传播中发挥重要作用,特别是其作为大量病毒的自然宿主的特性越来越受到科研工作者的重视。我国东南沿海地区是重要的对外交流市场,地处我国东南边陲,物资人口流动频繁,军事、经济战略意义突出。该地区气候温暖、雨量充沛,自然环境适合多种医学生物繁衍,现已知野生动物2000多种宿主动物和医学媒介生物群落异常丰富,是我国自然疫源性疾病多发、高发的地区。加强该地区野生动物所携带病原的监测,鉴定工作,防止野生动物源性(特别是蝙蝠)病原的跨种,跨境传播的可能,对于了解该地区野生动物生物多样性以及防止疾病传播具有重要意义。随着生物技术迅猛发展,以二代测序为代表的宏基因组学技术直接对环境中所有核酸序列进行高通量测序,为调查环境群落的物种多样性提供高效工具,成为发现新病毒的有效手段。为深入了解我国东南沿海地区蝙蝠携带病毒谱信息,本研究通过病毒宏基因组学技术,对该地区2015年-2017年间所采集的蝙蝠标本进行病毒谱调查,并针对其携带的重要病毒蝙蝠源性SARS样冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome-Like-Coronavirus,SL-CoV)展开深入研究。主要研究内容和结果如下:1.宏基因组学研究中国东南沿海蝙蝠携带病毒谱。为了解中国东南沿海地区蝙蝠可能携带的病原种类,本研究基于宏基因测序技术对中国东南沿海6个哨点地区共计235只蝙蝠肠和肺组织进行高通量测序,结果共获得5990261条高质量读长(reads),其中有2975371条reads拼接合并成重叠序列,有631490条重叠序列成功预测为ORF,注释匹配为病毒的ORF占2.37%(15012/631490)。进一步分类整理发现,病毒序列共涉及25个病毒科。包括16个脊椎动物病毒科;4个植物病毒科和5个昆虫病毒科。通过BLAST比对和进化分析提示可能发现新的进化分支的病毒;通过首次在中国东南沿海地区对蝙蝠携带病毒谱的调查,丰富了对蝙蝠作为病原体库的认识,同时为下一步分离培养蝙蝠携带病毒并进一步分析病毒在蝙蝠和人类间传播的可能提供了理论依据。2.重要病原的PCR验证分析。为了验证宏基因测序结果可靠性,根据测序结果,选取与人类致病密切相关且经过BLAST比对后6种病毒(冠状病毒,腺病毒,星状病毒,圆环病毒,诺如病毒,博卡病毒)对所有235只蝙蝠组织核酸进行PCR扩增验证和进化分析。结果不同蝙蝠种类中以菲菊头蝠携带病毒谱最广,分别携带冠状病毒,腺病毒,诺如病毒,圆环病毒,星状病毒,其中以冠状病毒携带率最高,在舟山,长乐,石狮组中检出率为6.8%-18.2%;而在其余蝙蝠种类中,首次在2只大卫鼠耳蝠检测到博卡病毒,一只度赖氏鼠耳蝠中检测到星状病毒。PCR验证结果与宏基因测序结果基本一致,提示宏基因测序技术对于发现环境中新病毒具有指导意义。3.对舟山地区蝙蝠携带冠状病毒进行鉴定研究。本研究运用RT-PCR法对2015年7月至2017年2月间采集的334只蝙蝠进行冠状病毒携带率的调查,结果显示冠状病毒的总携带率为26.65%(9/334)。通过重叠PCR(overlap PCR)和末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)的方法,成功获得了两株SARS样冠状病毒的全长序列,两株病毒株的全长比对分析发现该两株核酸序列之间的同源性高达99%,系统进化分析显示该两株病毒属于β冠状病毒中一个新的分支,这两株新病毒基因组与果子狸SARS冠状病毒(SARS-CoV)SZ3株的总核苷酸序列同源性为81%,低于之前报道的关于中国蝙蝠SL-CoVs的观察结果(88-92%),推测该病毒株为两株新的病毒。4.新鉴定的SL-CoVs病毒株致病力研究。以新鉴定的SL-CoVs ZC45株蝙蝠组织上清感染乳鼠,病理结果显示乳鼠各组织脏器出现炎症反应,且通过脑组织的电镜观察结果发现了冠状病毒样病毒颗粒,蛋白免疫印迹实验(Western blot)分析发现感染乳鼠组织能够和该病毒株核衣壳蛋白N蛋白的多克隆抗体发生反应,从而从抗原性证实该病毒株能够感染乳鼠,通过乳鼠致病实验进一步探讨了该病毒株的跨种传播的可能。综上所述,本研究通过对在我国东南沿海地区3年间采集的蝙蝠进行的宏基因组学测序调查研究,丰富了该地区的蝙蝠携带的病毒谱认识,同时也极大的促进了我们对蝙蝠携带病毒库的多样性的认识;通过我们对新发现的重要病原的鉴定研究,对重要病原的进化关系进行了系统阐述,为该地区蝙蝠携带病毒的基础数据提供了线索;本研究选取该地区携带率高且与人类致病密切相关的SARS样冠状病毒进行系统研究,发现该地区携带的SARS样冠状病毒为一全新的β冠状病毒的分支,更为重要的是通过乳鼠致病实验发现其能够引发乳鼠致病,表明其具备跨种传播的可能,这也提示我们继续监测该地区蝙蝠源性的病原谱的重要性,同时也为蝙蝠病毒的监测预警和预防新发传染病的发生提供了理论参考。