论文部分内容阅读
背景与目的 肠易激综合征(IBS)是一种以腹痛伴有排便频率和/或粪便性状改变的功能性胃肠病,目前发病机制仍待阐明。研究发现IBS患者存在多层面免疫系统激活,尤其是部分IBS患者血清中存在多种抗神经元抗体(aNA),可引起针对肠神经系统(ENS)的免疫反应,导致ENS内神经元损伤。慢性假性肠梗阻(CIPO)患者aNA阳性血清能促使神经细胞自噬,而IBS患者抗肠神经元抗体(AENA)阳性血清能导致肠神经元凋亡。本研究目的:明确IBS患者抗HuD抗体阳性血清或商品化抗HuD抗体能否导致神经细胞自噬,并阐释其损伤机制,探究抗HuD抗体在IBS发病中的病理生理作用。材料与方法 采用符合罗马Ⅲ诊断标准的IBS患者和健康受试者血清,参考前期应用间接免疫荧光法检测AENA、HuProtTM芯片检测血清中差异性抗体的结果。分别选择IBS患者AENA阴性且差异性抗体阴性血清(AENA-/PRO-组)、AENA阳性且抗HuD抗体阴性血清(AENA+/HuD-组)、AENA阴性且抗HuD抗体阳性血清(AENA-/HuD+组)、商品化单克隆鼠抗人HuD抗体(anti-HuD组)、健康受试者血清(HCs组)孵育培养SH-Sy5Y细胞24小时,并用胎牛血清(FBS组)孵育作为阴性对照,用雷帕霉素(rapamycin组)诱导自噬作为阳性对照。倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞活性,间接免疫荧光法(抗LC3-Ⅱ/抗PGP 9.5/DAPI染色)检测神经细胞自噬,western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、Beclin-1的表达;透射电镜观察细胞超微结构的改变,明确有无自噬体的形成。结果 倒置显微镜下见anti-HuD组细胞生长密度减小,胞体缩小,细胞形态不规则,突起减少,折光性减弱;FBS组、HCs组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和AENA-/HuD+组细胞形态正常,生长良好。CCK-8检测细胞活性显示:anti-HuD组细胞活性显著低于FBS组、HCs组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和AENA-/HuD+组(P<0.05)。间接免疫荧光显示:除rapamycin组外,其余各组均未见胞浆内抗LC3-II抗体绿色荧光浓聚,提示无自噬体形成。Western blot检测自噬相关蛋白表达量,结果显示 FBS 组、HCs 组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组、AENA-/HuD+组和anti-HuD组间LC3-II蛋白表达量无显著差异(均P>0.05),且均显著低于rapamycin 组(P<0.05)。HCs 组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和 AENA-/HuD+组P62蛋白表达量显著高于FBS组、anti-HuD组和rapamycin组(P<0.05),rapamycin 组 P62 蛋白表达量低于 FBS 组(P<0.05);AENA+/HuD-组、AENA-/HuD+组和anti-HuD组p-mTOR蛋白表达量显著高于FBS组(P<0.05),AENA-/HuD+组和anti-HuD组p-mTOR蛋白表达量显著高于HCs组,而rapamycin组p-mTOR蛋白表达量较其余各组均显著减少(P<0.05);AENA-/HuD+组、anti-HuD组和rapamycin组Beclin-1蛋白相对表达量显著高于FBS组(P<0.05)。电镜观察见HCs组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和AENA-/HuD+组神经细胞胞质疏松,形成空洞,且可见脂滴和糖原堆积;Anti-HuD组同样可见部分细胞存在胞质疏松、脂滴增多和糖原堆积现象,且可见死亡细胞;除rapamycin组外,其余各组内均未见自噬体形成。结论 商品化单克隆鼠抗人HuD抗体可显著引起SH-Sy5Y细胞损伤和死亡,该作用可能是通过抑制细胞自噬,激活细胞凋亡或坏死等其他途径实现的。IBS患者抗HuD抗体阳性血清可致SH-Sy5Y细胞损伤并影响自噬通路相关蛋白的表达。人血清,特别是IBS患者血清中的部分物质可影响SH-Sy5Y细胞的糖脂代谢过程,对细胞造成损伤。抗HuD抗体所致神经元损伤可能与部分IBS患者的发病相关。