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贵州安顺职院,贵州 安顺 561000
【摘 要】:目的:建立地椒草中木犀草素含量测定的HPLC方法;方法: Diamonsil C18(5μm,250×4.6i.d.mm,迪马公司);流动相:甲醇-水-磷酸(60︰40︰0.4);流速:1ml/min;温度:35℃;检测波长为350nm;结果:木犀草素在100.12~800.96ng范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.9999,地椒草药材平均回收率为97.95%,RSD为0.97%;结论:HPLC测定地椒草中木犀草素结果准确可靠,快速,灵敏,重现性好｡
【关键词】:地椒草;木犀草素;高效液相色谱法;含量测定
【中图分类号】R927.2【文献标识码】B【文章编号】1007-8517(2009)03(上)0029-02
地椒草Thymus vulgaris[1]为唇形科地椒草属植物,主要分布于西藏､青海等省,为藏族和蒙古族等民间传统常用草药｡具有消炎止痛,活血化淤等功效,用于治疗跌打损伤,筋骨疼痛,骨质松炎等症[2,3]｡主要含有黄酮类[4]､环烯醚萜类[5]成分｡目前尚未见有关地椒草中指标性成分木犀草素含量测定方法的报道｡本文建立了地椒草中木犀草素的HPLC含量测定方法及测定了不同批次药材中其含量｡
1 仪器和材料
高效液相色谱仪:LC-10ATvp泵(美国),SPD-10Avp紫外检测器(美国),CTO-10Asvp柱温箱(美国);Shimadzu Libror AEL 40SM(十万分之一)天平(日本岛津所)｡
色谱甲醇(天津市科密欧化学试开发中心);水(重蒸馏,临用前制备);木犀草素对照品(中国生物制品鉴定所,批号:111520-200201)样品三批(批号:20040101､20040102､20040103)
2 方法与结果
色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(5μm,250×4.6 i.d.mm,迪马公司);流动相:甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.4);流速:1ml/min;温度:35℃;检测波长为350nm｡在此条件下,药材中木犀草素与其他成分能很好地分离｡以工作站中的色谱峰纯度分析和光谱匹配对照对所得色谱图进行分析｡结果地椒草药材中木犀草素峰的纯度角(Purity Angle)为0.846,阈值(Threshold)为1.914;光谱匹配角(Match Angle)为0.384,阈值(Match Threshold)为1.838,在210~400nm范围内与对照品有很好的光谱匹配｡
对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的木犀草素对照品适量,加甲醇制成每1ml含木犀草素40μg的溶液,即得｡
线性范围的考察 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的木犀草素对照品10.12mg置100ml棕色容量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含木犀草素100.12μg的对照品储备液;精密吸取该液2.5､5､10､15､20ml,置25ml棕色容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含木犀草素10.012､20.024､40.048､60.072､80.096μg的系列对照品溶液,分别精密吸取上述系列对照品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,记录色谱图,测定结果见表1,并以对照品进样量X(ng)为横坐标,峰面积值Y(mv.s)为纵坐标,绘制标准曲线,结果表明,木犀草素在100.12~800.96ng范围内线性关系良好｡
精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl,重复进样5次,测定木犀草素峰面积积分值,求出相对标准偏差,结果表明,木犀草素进样精密度良好,RSD=0.65%｡
2.1 重复性试验 取地椒草 药材(批号:20040103)粉末各2g,共5份,按地椒草药材供试液的制备方法制备供试液｡精密吸取供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定木犀草素峰面积积分值,计算含量,求相对标准偏差;结果表明此方法测定木犀草素的重现性良好,RSD= 1.09%｡
2.2稳定性试验 取地椒草药材(批号:20040103)粉末2g,按地椒草 药材供试液的制备方法制备供试液,在室温下按表4规定时间进样,测定木犀草素峰面积值,求相对标准偏差;结果表明,木犀草素在24小时内基本稳定,RSD=0.84%｡
2.3 回收率试验 采用加样回收试验,取已知含量的重现性试验的同一批样品(批号:20040103,木犀草素平均含量为1.51mg/g)5份,精密称取各约1g,分别加入木犀草素对照品溶液(0.3019mg/ml)5ml,按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液,照上述色谱条件,进样､测定,记录色谱图,计算含量,求相对标准偏差,RSD=0.97%,结果表明,此方法具有较好的加样回收率,结果见表1｡
2.4 供试品溶液的制备及样品测定 取本品粉末(过3号筛)2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml,称定重量,于90℃水浴中加热回流1小时,放冷,再称定重量,用2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取续滤液2ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,以微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得｡
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得｡结果见表2
3 讨论
3.1 比较了多种甲醇,水,磷酸比例,最终确定了甲醇-水-磷酸的比例为60∶40∶0.4最为合适,木犀草素的最大吸收波长为349.8nm,故检测波长选择了350nm｡
3.2 在样品前处理方法中,比较了甲醇浓度､浸泡时间和超声时间对木犀草素提取率的影响,最终确定了提取方法｡
参考文献
[1]中国科学院四川分院中医中药研究所 四川中药志[M].成都:四川人民出版社,1961 1127.
[2]青海省生物研究所.青藏高原植物图鉴(第一册)[M].西宁:青海人民出版社,1972 100.
[3]梁重栋 藏药地椒草 的基础与临床研究[J].兰州医学院学报,1987,13(2):47 49.
[4]张兆琳,张承忠,李冲,等.藏药地椒草中黄酮类化合物的研究[J].兰州医学院学报,1989,15(4):205 208.
[5]易进海,钟炽昌,罗泽渊,等.藏药地椒草根化学成分的研究[J].药学学报(Acta Pharm Sin),1990,26(1):37 41.
[6]Yoshio Takeda,Hiroyuki Matsumura,Toshiya Masuda,etal Phlorigidoside AC,iridoid glucoseides from Phlomisrigida [J].Phytochemistry,2000,53:931 935
(收稿日期:2008.12.2)
【摘 要】:目的:建立地椒草中木犀草素含量测定的HPLC方法;方法: Diamonsil C18(5μm,250×4.6i.d.mm,迪马公司);流动相:甲醇-水-磷酸(60︰40︰0.4);流速:1ml/min;温度:35℃;检测波长为350nm;结果:木犀草素在100.12~800.96ng范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.9999,地椒草药材平均回收率为97.95%,RSD为0.97%;结论:HPLC测定地椒草中木犀草素结果准确可靠,快速,灵敏,重现性好｡
【关键词】:地椒草;木犀草素;高效液相色谱法;含量测定
【中图分类号】R927.2【文献标识码】B【文章编号】1007-8517(2009)03(上)0029-02
地椒草Thymus vulgaris[1]为唇形科地椒草属植物,主要分布于西藏､青海等省,为藏族和蒙古族等民间传统常用草药｡具有消炎止痛,活血化淤等功效,用于治疗跌打损伤,筋骨疼痛,骨质松炎等症[2,3]｡主要含有黄酮类[4]､环烯醚萜类[5]成分｡目前尚未见有关地椒草中指标性成分木犀草素含量测定方法的报道｡本文建立了地椒草中木犀草素的HPLC含量测定方法及测定了不同批次药材中其含量｡
1 仪器和材料
高效液相色谱仪:LC-10ATvp泵(美国),SPD-10Avp紫外检测器(美国),CTO-10Asvp柱温箱(美国);Shimadzu Libror AEL 40SM(十万分之一)天平(日本岛津所)｡
色谱甲醇(天津市科密欧化学试开发中心);水(重蒸馏,临用前制备);木犀草素对照品(中国生物制品鉴定所,批号:111520-200201)样品三批(批号:20040101､20040102､20040103)
2 方法与结果
色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(5μm,250×4.6 i.d.mm,迪马公司);流动相:甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.4);流速:1ml/min;温度:35℃;检测波长为350nm｡在此条件下,药材中木犀草素与其他成分能很好地分离｡以工作站中的色谱峰纯度分析和光谱匹配对照对所得色谱图进行分析｡结果地椒草药材中木犀草素峰的纯度角(Purity Angle)为0.846,阈值(Threshold)为1.914;光谱匹配角(Match Angle)为0.384,阈值(Match Threshold)为1.838,在210~400nm范围内与对照品有很好的光谱匹配｡
对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的木犀草素对照品适量,加甲醇制成每1ml含木犀草素40μg的溶液,即得｡
线性范围的考察 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的木犀草素对照品10.12mg置100ml棕色容量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含木犀草素100.12μg的对照品储备液;精密吸取该液2.5､5､10､15､20ml,置25ml棕色容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含木犀草素10.012､20.024､40.048､60.072､80.096μg的系列对照品溶液,分别精密吸取上述系列对照品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,记录色谱图,测定结果见表1,并以对照品进样量X(ng)为横坐标,峰面积值Y(mv.s)为纵坐标,绘制标准曲线,结果表明,木犀草素在100.12~800.96ng范围内线性关系良好｡
精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl,重复进样5次,测定木犀草素峰面积积分值,求出相对标准偏差,结果表明,木犀草素进样精密度良好,RSD=0.65%｡
2.1 重复性试验 取地椒草 药材(批号:20040103)粉末各2g,共5份,按地椒草药材供试液的制备方法制备供试液｡精密吸取供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定木犀草素峰面积积分值,计算含量,求相对标准偏差;结果表明此方法测定木犀草素的重现性良好,RSD= 1.09%｡
2.2稳定性试验 取地椒草药材(批号:20040103)粉末2g,按地椒草 药材供试液的制备方法制备供试液,在室温下按表4规定时间进样,测定木犀草素峰面积值,求相对标准偏差;结果表明,木犀草素在24小时内基本稳定,RSD=0.84%｡
2.3 回收率试验 采用加样回收试验,取已知含量的重现性试验的同一批样品(批号:20040103,木犀草素平均含量为1.51mg/g)5份,精密称取各约1g,分别加入木犀草素对照品溶液(0.3019mg/ml)5ml,按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液,照上述色谱条件,进样､测定,记录色谱图,计算含量,求相对标准偏差,RSD=0.97%,结果表明,此方法具有较好的加样回收率,结果见表1｡
2.4 供试品溶液的制备及样品测定 取本品粉末(过3号筛)2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml,称定重量,于90℃水浴中加热回流1小时,放冷,再称定重量,用2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失重量,摇匀,滤过,精密吸取续滤液2ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,以微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得｡
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得｡结果见表2
3 讨论
3.1 比较了多种甲醇,水,磷酸比例,最终确定了甲醇-水-磷酸的比例为60∶40∶0.4最为合适,木犀草素的最大吸收波长为349.8nm,故检测波长选择了350nm｡
3.2 在样品前处理方法中,比较了甲醇浓度､浸泡时间和超声时间对木犀草素提取率的影响,最终确定了提取方法｡
参考文献
[1]中国科学院四川分院中医中药研究所 四川中药志[M].成都:四川人民出版社,1961 1127.
[2]青海省生物研究所.青藏高原植物图鉴(第一册)[M].西宁:青海人民出版社,1972 100.
[3]梁重栋 藏药地椒草 的基础与临床研究[J].兰州医学院学报,1987,13(2):47 49.
[4]张兆琳,张承忠,李冲,等.藏药地椒草中黄酮类化合物的研究[J].兰州医学院学报,1989,15(4):205 208.
[5]易进海,钟炽昌,罗泽渊,等.藏药地椒草根化学成分的研究[J].药学学报(Acta Pharm Sin),1990,26(1):37 41.
[6]Yoshio Takeda,Hiroyuki Matsumura,Toshiya Masuda,etal Phlorigidoside AC,iridoid glucoseides from Phlomisrigida [J].Phytochemistry,2000,53:931 935
(收稿日期:2008.12.2)