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摘要：【目的】探讨适宜带叶兜兰（Paphiopedilum hirsutissimum）离体培养的培养基组分，为规模化生产带叶兜兰组培苗提供技术支持。【方法】以带叶兜兰组培苗为外植体，筛选适合其丛生芽诱导、增殖和壮苗生长的基本培养基、附加物种类和生长激素组合。【结果】初步筛选出较适宜带叶兜兰丛生芽诱导的培养基为1/2MS+3.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+80.0 g/L香蕉汁+2.0 g/L活性炭，其诱导率较高，为36.1%，且丛生芽诱导出芽较多；丛生芽增殖培养基为1/2MS+0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D+80.0 g/L香蕉汁+2.0 g/L活性炭，其增殖系数为2.02，芽生长较快；壮苗生长最适宜培养基为1.0 g/L花宝1号+1.0 g/L花宝2号+MS培养基的有机、微量成分+1.0 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 g/L香蕉汁+1.5 g/L蛋白胨，其幼苗生长较好，生物量大，生根率达75.5%。【结论】在1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭培养基中添加香蕉汁较适宜带叶兜兰丛生芽诱导和增殖培养；在1/2MS+80.0 g/L香蕉汁培养基中添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D对带叶兜兰的增殖效果较佳；花宝改良培养基适宜带叶兜兰壮苗培养，结合添加NAA和活性炭培养效果更佳，但活性炭浓度不宜过高。
关键词： 带叶兜兰；离体培养；培养基组分；基本培养基
中图分类号： S682.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1730-07
0 引言
【研究意义】兜兰属（Paphiopedilum）又称为拖鞋兰、仙履兰，是兰科植物中濒危程度最高的种群。由于野生种群小、个体数量少、分布区域有限，兜兰属所有种均被列入野生动植物濒危物种国际贸易公约（CITES）附录I的保护范围（罗毅波等，2003）。兜兰是最具观赏价值的兰花类群之一，带叶兜兰（P. hirsutissimum）是兜兰属栽培适应性较好的原生种类，花色庄重素雅，花形奇特，市场需求量大。然而，自然条件下兜兰的繁殖力极弱，成苗缓慢。因此，利用离体快繁技术解决带叶兜兰资源保护与开发利用的矛盾，对带叶兜兰新品种选育及优良兜兰品种的商品化生产具有重要意义。【前人研究进展】近年来，针对兜兰的研究主要集中在生态学（刘仲健等，2006）、遗传学、杂交育种、传粉生物学（史军等，2007）、无菌播种（曾宋君等，2007；张娟娟等，2013）、引种栽培及菌根真菌（孙晓颖，2014）等方面，并取得了一定的进展。陈之林等（2004）研究发现，低盐浓度培养基添加椰子汁可促进杏黄兜兰（P. armeniacum）和硬叶兜兰（P. micranthum）种子萌发，育苗培养基中添加活性炭和香蕉汁有利于其种子苗生长。丁长春等（2004）研究认为，杏黄兜兰种子在低盐浓度的1/5MS中萌发效果最佳，且添加椰子汁可促进其萌发，添加香蕉汁则抑制其萌发，添加活性炭（2.0 g/L）能促使其萌发和幼苗发育。曾宋君等（2006）研究带叶兜兰离体快繁技术，结果表明，RE和花宝是较好的培养基，增殖过程中添加活性炭可防止玻璃化苗，添加香蕉汁有利于壮苗生根培养。曾宋君等（2006）、丁长春和夏念和（2009）还开展了亨利兜兰（P. henryanum）、彩云兜兰（P. wardii）、麻栗坡兜兰（P. malipoense）等十多种兜兰的无菌培养技术研究，为国内兜兰组培技术的早期探索打下了基础。此外，田凡等（2014）、尤佳妍等（2014）對兜兰组培技术进行了深入研究。【本研究切入点】目前，带叶兜兰组织培养的培养基尚存在增殖率和移栽成活率不高等问题，而有关增加带叶兜兰的繁殖系数及培育壮苗方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】探讨不同基本培养基、添加物种类和生长激素组合对带叶兜兰组培苗丛生芽诱导、增殖和幼苗生长的影响，筛选适合其诱导、增殖及壮苗生根的培养基组分，为规模化生产带叶兜兰组培苗提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
带叶兜兰蒴果采自广西河池天峨龙滩自然保护区。将带叶兜兰蒴果清洗干净，去除表面绒毛后用75%乙醇消毒1 min，5%次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗4次，剖开种皮后取出种子播种在花宝1号+1.0 g/L NH4NO3培养基上（图1-a），暗培养30 d后于25 ℃、光照强度2000 lx环境下培养60 d，然后选择生长健康、长势一致的无菌幼苗作为试验材料。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 丛生芽诱导和增殖培养 取具2～3片叶且无根或极少根的兜兰小植株，以RE、花宝（1.5 g/L花宝1号+1.5 g/L花宝2号）、1/2MS及MS等4种培养基为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂和有机物，进行带叶兜兰丛生芽诱导及增殖培养的培养基筛选；以筛选出适宜兜兰丛生芽诱导的1/2MS培养基为基本培养基，设添加椰子汁（150.0 mL/L）和香蕉汁（100.0 g/L）两种添加物处理，以不添加附加物为对照（CK1），并设添加0.1 mg/L NAA配合0、1.5和3.0 mg/L 6-BA 3种浓度处理，筛选适宜丛生芽诱导的添加物和激素浓度。增殖阶段培养基采用适宜丛生芽诱导的1/2MS培养基，添加80.0 g/L香蕉汁，进一步通过添加不同种类和浓度植物激素，对丛生芽增殖情况进行比较，以不添加激素为对照（CK2），具体配方见表4。每处理15瓶，3次重复，诱导试验每瓶3株，90 d后以瓶为单位统计诱导率、增殖系数、黄化率、成活率和植株生长情况；增殖试验每瓶5丛，每丛2株，90 d后以瓶为单位统计增殖系数、芽株高和植株生长情况。诱导率、增殖系数、黄化率、成活率参考秦丽凤和石贵玉（2013）、叶维雁等（2015）、祝剑峰等（2015）的方法进行计算。 诱导率（%）=萌芽株数/接种总株数×100
增殖系数=增殖的新芽数/每瓶接入芽数
黄化率（%）=黄化株数/接种总株数×100
成活率（%）=成活株数/接种总株数×100
1. 2. 2 壮苗及生根培养 取具2～3片叶、2～3条根的兜兰植株，以RE、花宝（1.0 g/L花宝1号+1.0 g/L花宝2号）、花宝改良（1.0 g/L花宝1号+1.0 g/L花宝2号+MS培养基的有机、微量成分）、MS等4种培养基为基本培养基，分别添加1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA、2.0 g/L活性炭，筛选适宜兜兰壮苗和生根的基本培养基；以花宝改良为基本培养基，附加2.0 g/L活性炭，添加NAA和6-BA两種生长激素，筛选适宜壮苗生长的激素组合；以花宝改良为基本培养基，附加0、2.0和4.0 g/L活性炭，筛选适宜壮苗生长的活性炭浓度。每处理15瓶，每瓶3株，3次重复。90 d后以瓶为单位统计植株鲜重、叶长、叶宽、根系长度、新根数及生根率等生长指标。
生根率（%）=生根株数/接种总株数×100
1. 2. 3 培养条件 上述增殖培养基均添加4.8 g/L琼脂、20.0 g/L蔗糖；壮苗及生根培养基均添加5.0 g/L琼脂、30.0 g/L蔗糖、1.5 g/L蛋白胨、80.0 g/L香蕉汁；pH 5.8。培养条件为25 ℃，每天光照12 h，光照强度2000 lx，培养周期为90 d。其中，增殖期间先暗培养30 d，再转为光照培养。
1. 3 统计分析
试验数据利用Excel 2003和DPS 7.05进行统计分析。
2 结果与分析
2. 1 兜兰丛生芽的诱导和增殖
2. 1. 1 不同基本培养基对带叶兜兰丛生芽诱导的影响
由表1可知，不同基本培养基对带叶兜兰丛生芽诱导率存在差异，但整体诱导率不高，增殖系数较小。其中，在添加1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和2.0 g/L活性炭的4种基本培养基上，以1/2MS培养基的芽诱导率最高，为15.2%，花宝培养基的最低，为6.7%，二者间差异极显著（P<0.01，下同），且前者的丛生芽萌发最早，接种后20 d即出现芽萌动，芽长势旺盛，无黄化、变异及死亡等不良生长现象，后者植株的死亡率最高，达12.5%，与前者差异极显著。RE培养基诱导的丛生芽黄化率达15.1%，并伴少量植株死亡，MS培养基诱导的丛生芽植株也有死亡现象。说明1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭较适合作为带叶兜兰丛生芽诱导的培养基。
2. 1. 2 不同天然添加物对带叶兜兰丛生芽诱导的影响
由表2可知，在1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 2.0 g/L活性炭基础上添加椰子汁的培养基中带叶兜兰丛生芽诱导率较高，为22.1%，与添加香蕉汁的诱导率（20.5%）差异显著（P<0.05，下同），植株鲜绿，偶见黄化和芽死亡，而添加香蕉汁培养基中芽的增殖系数较大，达1.34，极显著大于添加椰子汁的培养基及CK1，植株无黄化现象，但植株会偶发变异。丛生芽诱导出芽成活率以添加香蕉汁的培养基较高，但与添加椰子汁培养基及CK1的差异不显著（P>0.05，下同）。因此，1/2MS+ 1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁适宜作为带叶兜兰丛生芽诱导的培养基。
2. 1. 3 不同浓度6-BA对带叶兜兰丛生芽诱导的影响
由表3可知，在添加0.1 mg/L NAA的条件下，随着6-BA用量的增加，带叶兜兰丛生芽的诱导效果得到明显改善。其中，添加3.0 mg/L 6-BA的培养基带叶兜兰丛生芽诱导率为36.1%，极显著高于添加0～1.5 mg/L 6-BA的培养基；增殖系数为1.47，比添加0～1.5 mg/L 6-BA的培养基提高了42.7%和21.5%，且无植株黄化，该培养基上诱导的丛生芽成活率高，生长旺盛，叶片油绿（图1-b）。说明可将2.1.2中适宜带叶兜兰丛生芽诱导的培养基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁调整为1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁。
2. 1. 4 不同激素组合对带叶兜兰丛生芽增殖的影响
为扩大诱导获得的丛生芽数量，在增殖培养中进一步调整激素种类和用量以筛选最佳增殖培养基组分。由表4可知，在1/2MS培养基中添加不同激素种类和用量的带叶兜兰丛生芽增殖系数差异不显著，其中，添加TDZ和2，4-D处理的增殖系数较大，其次是添加NAA和6-BA处理，但丛生芽偶见变异，添加KT处理的增殖系数较小。在添加TDZ和2，4-D的处理中，以添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D为最适的带叶兜兰丛生芽增殖激素组合，无植株死亡，增殖系数达2.02，平均芽株高1.83 cm，极显著高于除3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA外的其他处理；TDZ浓度增加至0.3 mg/L或2，4-D浓度减少至1.0 mg/L均会极显著抑制新芽的生长发育；添加0.1 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D处理的增殖系数达1.92，平均芽株高1.63 cm，极显著高于CK2，新芽叶油绿、长势较好，仍可用于进行带叶兜兰丛生芽增殖；添加5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA处理的增殖系数为1.83，也可用于带叶兜兰丛生芽增殖，但芽株高较矮，为1.43 cm；添加3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA处理的增殖系数为1.53，但芽生长较好，株高（1.73 cm）显著高于CK2，亦可用于带叶兜兰丛生芽增殖。添加KT处理的丛生芽增殖系数小，尤其是添加1.0 mg/L KT处理，芽极矮小，生长较弱，不宜用于带叶兜兰丛生芽增殖。 2. 2 兜兰丛生芽增殖苗的壮苗和生根培养
2. 2. 1 不同基本培养基对带叶兜兰增殖苗壮苗和生根的影响 由表5可知，在添加1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA及80.0 g/L香蕉汁的4种基本培养基上，带叶兜兰增殖苗均能正常生长，培养到120 d时，4种基本培养基上增殖苗的鲜重间及叶片长度间差异不显著；增殖苗在花宝改良培养基上生长效果最佳，植株叶片宽展，浓绿有光泽，根系发达，新根萌发多且长，生根率达75.5%，极显著高于其他处理，新根萌发数分别比MS、RE和花宝培养基提高94.3%、54.5%和61.9%，差异显著；根系长度比RE、花宝及MS培养基分别提高197.4%、175.6%和264.5%，且差异极显著。此外，花宝改良培养基的叶片宽比花寶培养基提高20.0%，差异显著。在RE和MS培养基上，带叶兜兰叶片失绿较明显，叶色暗淡，尤其是在MS培养基上，叶片出现白化现象较多，且叶细长，生根率仅58.1%，极显著低于RE和花宝改良培养基，显著低于花宝培养基。
可见，花宝改良培养基有利于兜兰幼苗叶幅增大、新根萌发和伸长，促进幼苗地上部分和地下部分协同增长，花宝、RE和MS培养基增殖苗的生长情况依次变差，说明低盐培养基更适合于带叶兜兰的壮苗培养，丰富的微量和有机元素能有效促进兜兰组培苗对营养物质的吸收和生物量的积累（图1-c）。
2. 2. 2 不同生长激素对带叶兜兰幼苗壮苗和生根的影响 由表6可知，在添加了香蕉汁和活性炭的花宝改良培养基上，添加生长激素NAA和6-BA对带叶兜兰幼苗的生物量、叶片宽度和生根率均有一定的提高作用。其中，添加1.0 mg/L NAA培养基中幼苗的长势最佳，主要表现在鲜重增加明显、叶片宽大平展及根系粗壮等方面，尤其是鲜重和叶片宽度显著或极显著高于不添加NAA或添加NAA+6-BA的培养基。在生根率方面，添加NAA的培养基比不添加NAA的培养基提高35.2%，差异显著，与添加NAA+6-BA的培养基差异不显著。因此，添加1.0 mg/L NAA能较好地促进带叶兜兰幼苗生长，但结合0.1 mg/L 6-BA使用后，兜兰地上部分生长量较小，说明6-BA在一定程度上弱化了NAA促进兜兰生长的作用。
2. 2. 3 不同浓度活性炭对带叶兜兰壮苗和生根的影响 由表7可知，在花宝改良培养基中添加活性炭可促进带叶兜兰组培苗生根，促进根的生长和新根的分化，且对幼苗的生物量积累和叶面积增大产生了良好的促进作用，其中，以添加2.0 g/L活性炭幼苗的长势较佳，鲜重比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分别提高62.5%和30.0%，差异达极显著或显著水平；叶片长度比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分别提高24.1%和16.0%，差异均达极显著或显著水平；根系长度比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分别提高117.6%和37.0%，差异极显著或显著；生根率比不添加活性炭提高74.4%，差异极显著，但与添加4.0 g/L活性炭差异不显著。说明活性炭不仅为根的生长提供了较好的暗环境，还能吸附一部分幼苗生长过程中产生的代谢物和有毒物质。因此，添加2.0 g/L活性炭的培养基较适宜带叶兜兰壮苗生长，组培苗移栽后较易成活（图1-d）。
3 讨论
带叶兜兰是介于附生与地生间的兰科植物，离体培养过程中试管苗发育较缓慢，一定时间内的繁育数量受限，移栽难度较大，通过组织培养方法进行其丛生芽增殖和培育壮苗是快速扩大组培苗数量和促进组培苗移栽成活的重要措施。兜兰的试管成苗过程受兜兰种类、外植体种类、光照时间、培养基种类、有机添加物类型等条件影响（Pierik et al.，1988；Zeng et al.，2011，2012）。本研究结果表明，1/2MS培养基对带叶兜兰的增殖效果较佳，丛生芽萌动早，新芽质量好且生长量大，而其他培养基会出现芽死亡或黄化现象，说明降低培养基的无机盐浓度有利于兜兰丛生芽的诱导，与杨燕萍等（2011）对亨利兜兰的研究结果相似。李慧敏等（2013）研究发现，培养基中天然有机添加物含有氨基酸、激素、酶等多种复杂成分，能促进白芨组培苗的增殖分化和生长，本研究结果与其相似，添加适量香蕉汁可有效提高兜兰的丛生芽增殖率。本研究发现，培养基中添加3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA对兜兰丛生芽诱导有较好的促进作用，丛生芽生长旺盛，无死亡或变异，增殖培养以添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D的效果较好，无植株死亡，芽生长量大，但兜兰丛生芽的增殖系数整体偏小，最大的仅2.02，明显小于丁长春和夏念和（2009）对麻栗坡兜兰、杨燕萍等（2011）对亨利兜兰丛生芽的增殖系数，其原因除了与所使用的兜兰种类、激素浓度和配比不同有关外，还可能与本研究使用的材料数量有限、尤其是诱导阶段每瓶内接种植株数量较少且为单植（带叶兜兰是群居性兰花）有关。本研究增殖培养中添加TDZ和2，4-D培养基虽可增殖丛生芽数量，但增殖系数增加有限，未产生多芽丛植的群聚效应。崔秋华等（2012）对齿瓣石斛丛生芽增殖的研究也认为，随着丛植芽数量的增多，增殖系数逐渐提高，5株一丛时有利于芽的增殖和生长。
组培苗生长健壮有利于移栽后缩短缓苗时间，提高其对外界环境的适应能力和抵抗能力。已有的研究表明，低盐浓度培养基适合多数兜兰组培苗的生长发育，高盐浓度培养基则抑制其幼苗的生长，但不同兜兰种类有其最适宜的培养基类型，如带叶兜兰（曾宋君等，2006）、麻栗坡兜兰（丁长春和夏念和，2009）和亨利兜兰（杨燕萍等，2011）等在花宝培养基上的壮苗生根效果较好，而报春兜兰适合在RE培养基中培育壮苗（周丽等，2013），小叶兜兰在1/2MS培养基上生长旺盛（尤佳妍等，2014）。本研究中使用的花宝改良培养基含盐量低，氮、磷、钾比例更适合培育带叶兜兰壮苗的需求，配合MS培养基中的有机及微量元素成分使用，兜兰植株叶幅增大，根系发达，能明显促进组培苗出瓶移栽成活。本研究采用NAA 1.0 mg/L即可较好地促进带叶兜兰幼苗生长，与丁长春和夏念和（2009）对多种兜兰、周丽等（2013）对报春兜兰、田凡等（2014）对白花兜兰、尤佳妍等（2014）对小叶兜兰的壮苗和生根研究结果相似。 活性炭具有强大的吸附能力，可吸附培养物在代谢过程中产生的有害物质，同时有利于根的向地性生长，在兜兰种子苗培养过程中还可防止酚污染和变褐老化，促进器官形成，减少玻璃化（陈宇勒，2009）。陈尔等（2014）和田凡等（2014）研究认为适量的活性炭对春兰及白花兜兰根的生长发育有重要作用。本研究设3个浓度活性炭添加量处理，结果发现以添加2.0 g/L的壮苗和生根效果最好，与曾宋君等（2006）、尤佳妍等（2014）的研究结果一致。
4 结论
在1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭培养基中添加香蕉汁较适宜带叶兜兰丛生芽诱导和增殖培养；在1/2MS+80.0 g/L香蕉汁培养基中添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D有助于提高带叶兜兰的增殖系数；花宝改良培养基适宜带叶兜兰壮苗培养，结合添加NAA和活性炭使用，生根效果更佳，但活性炭浓度不易过高。
参考文献：
陈尔，王华新，陈宝玲，农凤梅，李冰，苏莉花. 2014. 春兰根状茎增殖的影响因素[J]. 广西林业科学，43（3）：319-321.
Chen E，Wang H X，Chen B L，Nong F M，Li B，Su L H. 2014. Influence factors of Cymbidium goeringii rhizomes multiplication[J]. Guangxi Forestry Science，43（3）：319-321.
陈宇勒. 2009. 兰花繁育技术图解[M]. 广州：广东科技出版社.
Chen Y L. 2009. Orchid Breeding Technology Illustration[M]. Guangzhou：Guangdong Science and Technology Publishing House.
陈之林，叶秀粦，梁承邺，段俊. 2004. 杏黄兜兰和硬叶兜兰的种子试管培养[J]. 园艺学报，31（4）：540-542.
Chen Z L，Ye X L，Liang C Y，Duan J. 2004. Seed germination in vitro of Paphiopedilum armeniacum and P. micranthum[J]. Acta Horticulturae Sinica，31（4）：540-542.
崔秋华，孙永玉，李昆，周志美，段明伦. 2012. 不同因子对齿瓣石斛增殖系数和平均苗高的影响[J]. 中南林业科技大学学报，32（4）：200-203.
Cui Q H，Sun Y Y，Li K，Zhou Z M，Duan M L. 2012. Effects of different factors on proliferation coefficient of Dendrobium devonianum and average seedling height[J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology，32（4）：200-203.
丁長春，夏念和. 2009. 麻栗坡兜兰的无菌播种与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，45（2）：1201-1202.
Ding C C，Xia N H. 2009. Aseptic sowing and rapid propagation of Paphiopedilum malipoense S. C. Chen & Z. H. Tsi in vitro[J]. Plant Physiology Communications，45（2）：1201-1202.
丁长春，虞泓，刘方媛. 2004. 影响杏黄兜兰种子萌发的因素[J]. 云南植物研究，26（6）：673-677.
Ding C C，Yu H，Liu F Y. 2004. Factors affecting the germination of Paphiopedilum armeniacum[J]. Acta Botanica Yunnanica，26（6）：673-677.
李慧敏，杨冠海，李明静，闻永慧，张青华，李枝林. 2013. 白芨瓶内假鳞茎诱导研究[J]. 南方农业学报，44（10）：1607-1612.
Li H M，Yang G H，Li M J，Wen Y H，Zhang Q H，Li Z L. 2013. Bletilla striata pseudobulb induction in bottle[J]. Journal of Southern Agriculture，44（10）：1607-1612.
刘仲健，刘可为，陈利君，雷嗣鹏，李利强，施晓春，黄来强. 2006. 濒危物种杏黄兜兰的保育生态学[J]. 生态学报，26（9）：2791-2800.
Liu Z J，Liu K W，Chen L J，Lei S P，Li L Q，Shi X C，Huang L Q. 2006. Conservation ecology of endangered species Paphiopedilum armeniacum（Orchidaceae）[J]. Acta Ecologica Sinica，26（9）：2791-2800.
罗毅波，贾建生，王春玲. 2003. 初论中国兜兰属植物的保护策略及其潜在资源优势[J]. 生物多样性，11（6）：491-498.
Luo Y B，Jia J S，Wang C L. 2003. Conservation strategy and potential advantages of the Chinese Paphiopedilum[J]. Biodiversity Science，11（6）：491-498. 秦丽凤，石贵玉. 2013. 外源激素对杂交兰组培快繁的效应[J]. 南方农业学报，44（9）：1435-1438.
Qin L F，Shi G Y. 2013. Effects of exogenous growth regulators on rapid propagation of Cymbidium hybridum×Faberi[J]. Journal of Southern Agriculture，44（9）：1435-1438.
史军，程瑾，罗敦，上官法治，罗毅波. 2007. 利用传粉综合征预测：长瓣兜兰模拟繁殖地欺骗雌性食蚜蝇传粉[J]. 植物分类学报，45（4）：551-560.
Shi J，Cheng J，Luo D，Shangguan F Z，Luo Y B. 2007. Pollination syndromes predict brood-site deceptive pollination by female hoverflies in Paphiopedilum dianthum（Orchidaceae）[J]. Acta Phytotaxonomica Sinica，45（4）：551-560.
孙晓颖. 2014. 五种野生兜兰植物菌根真菌多样性研究[D]. 北京：北京林业大学.
Sun X Y. 2014. Diversity of mycorrhizal fungi isolated from five species of the genus Paphiopedilum[D]. Beijing：Beijing Forestry University.
田凡，姜运力，罗在柒，王莲辉. 2014. 白花兜兰种子无菌萌发及试管成苗技术研究[J]. 贵州林业科技，42（3）：34-38.
Tian F，Jiang Y L，Luo Z Q，Wang L H. 2014. Asymbiotic germination and in vitro seedling cultivation of Paphiopedilum emersonii[J]. Guizhou Forestry Science and Technology，42（3）：34-38.
杨燕萍，徐晓薇，姚丽娟，林霞，张庆良，张旭乐，黄建. 2011. 亨利兜兰茎尖诱导与离体快繁试验[J]. 农业科技通讯，（4）：53-55.
Yang Y P，Xu X W，Yao L J，Lin X，Zhang Q L，Zhang X L，Huang J. 2011. Shoot tips culture and in vitro propagation of Paphiopedilum henryanum[J]. Bulletin of Agricultural Science and Technology，（4）：53-55.
叶维雁，郭晓月，刘惠民，王连春，刘鹏，吴海波. 2015. 葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立[J]. 广西植物，35（6）：891-898.
Ye W Y，Guo X Y，Liu H M，Wang L C，Liu P，Wu H B. 2015. Establishment of rapid propagation for sterile seedlings of grapefruit by tissue culture[J]. Guihaia，35（6）：891-898.
尤佳妍，张毓，刘岩，程瑾，潘会堂，张启翔. 2014. 小叶兜兰的种子发育和无菌萌发[J]. 植物生理学报，50（3）：275-282.
You J Y，Zhang Y，Liu Y，Cheng J，Pan H T，Zhang Q X. 2014. Seed development and asymbiotic germination of Paphiopedilum barbigerum Tang et Wang[J]. Plant Physiology Journal，50（3）：275-282.
張娟娟，严宁，胡虹. 2013. 三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系[J]. 植物分类与资源学报，35（1）：33-40.
Zhang J J，Yan N，Hu H. 2013. The seed development of three Paphiopedilum species in relation to asymbiotic germination[J]. Plant Diversity and Resources，35（1）：33-40.
曾宋君，陈之林，段俊. 2006. 带叶兜兰的无菌播种和离体快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，42（2）：247.
Zeng S J，Chen Z L，Duan J. 2006. Asepsis sowing and in vitro propagation of Paphiopedilum hirsutissimum Pfitz[J]. Plant Physiology Communications，42（2）：247.
曾宋君，陈之林，吴坤林，段俊. 2007. 兜兰无菌播种和组织培养研究进展[J]. 园艺学报，34（3）：793-796.
Zeng S J，Chen Z L，Wu K L，Duan J. 2007. A resume of germination and mericlone of Paphiopedilum[J]. Acta Horticulturae Sinica，34（3）：793-796. 周丽，邓克云，徐正海. 2013. “金州报春”兜兰的非共生萌发与快速繁殖[J]. 植物生理学报，49（11）：1250-1254.
Zhou L，Deng K Y，Xu Z H. 2013. In vitro asymbiotic germination and propagation of Paphiopedilum primulinum ‘Jinzhou-
baochun’[J]. Plant Physiology Journal，49（11）：1250-1254.
祝剑峰，李芬，袁宇明，王丽珍. 2015. 鸢尾组织培养快速繁殖技术研究[J]. 江西农业学报，27（5）：25-28.
Zhu J F，Li F，Yuan Y M，Wang L Z. 2015. Research on tissue culture and rapid propagation of Iris[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（5）：25-28.
Pierik R L M，Sprenkels P A，Van Der Harst B，Van Der Meys Q G. 1988. Seed germination and further development of plantlets of Paphiopedilum ciliolare Pfitz. in vitro[J]. Scien-
tia Horticulturae，34（1）：139-153.
Zeng S J，Chen Z L，Wu K L，Zhang J X，Bai C K，Da Silva J A T，Duan J，Zeng S J. 2011. Asymbiotic seed germination，induction of calli and protocorm-like bodies，and in vitro seedling development of the rare and endangered Nothodoritis zhejiangensis Chinese orchid[J]. Hort Science，46（3）：460-465.
Zeng S J，Wu K L，Teixeira da silva J A，Zhang J X，Chen Z L，Xia N H，Duan J. 2012. Asymbiotic seed germination，seedling development and reintroduction of Paphiopedilum wardii Sumerh，an endangered terrestrial orchid[J]. Scientia Horticulturae，138（5）：198-209.
（責任编辑 思利华）
关键词： 带叶兜兰；离体培养；培养基组分；基本培养基
中图分类号： S682.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1730-07
0 引言
【研究意义】兜兰属（Paphiopedilum）又称为拖鞋兰、仙履兰，是兰科植物中濒危程度最高的种群。由于野生种群小、个体数量少、分布区域有限，兜兰属所有种均被列入野生动植物濒危物种国际贸易公约（CITES）附录I的保护范围（罗毅波等，2003）。兜兰是最具观赏价值的兰花类群之一，带叶兜兰（P. hirsutissimum）是兜兰属栽培适应性较好的原生种类，花色庄重素雅，花形奇特，市场需求量大。然而，自然条件下兜兰的繁殖力极弱，成苗缓慢。因此，利用离体快繁技术解决带叶兜兰资源保护与开发利用的矛盾，对带叶兜兰新品种选育及优良兜兰品种的商品化生产具有重要意义。【前人研究进展】近年来，针对兜兰的研究主要集中在生态学（刘仲健等，2006）、遗传学、杂交育种、传粉生物学（史军等，2007）、无菌播种（曾宋君等，2007；张娟娟等，2013）、引种栽培及菌根真菌（孙晓颖，2014）等方面，并取得了一定的进展。陈之林等（2004）研究发现，低盐浓度培养基添加椰子汁可促进杏黄兜兰（P. armeniacum）和硬叶兜兰（P. micranthum）种子萌发，育苗培养基中添加活性炭和香蕉汁有利于其种子苗生长。丁长春等（2004）研究认为，杏黄兜兰种子在低盐浓度的1/5MS中萌发效果最佳，且添加椰子汁可促进其萌发，添加香蕉汁则抑制其萌发，添加活性炭（2.0 g/L）能促使其萌发和幼苗发育。曾宋君等（2006）研究带叶兜兰离体快繁技术，结果表明，RE和花宝是较好的培养基，增殖过程中添加活性炭可防止玻璃化苗，添加香蕉汁有利于壮苗生根培养。曾宋君等（2006）、丁长春和夏念和（2009）还开展了亨利兜兰（P. henryanum）、彩云兜兰（P. wardii）、麻栗坡兜兰（P. malipoense）等十多种兜兰的无菌培养技术研究，为国内兜兰组培技术的早期探索打下了基础。此外，田凡等（2014）、尤佳妍等（2014）對兜兰组培技术进行了深入研究。【本研究切入点】目前，带叶兜兰组织培养的培养基尚存在增殖率和移栽成活率不高等问题，而有关增加带叶兜兰的繁殖系数及培育壮苗方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】探讨不同基本培养基、添加物种类和生长激素组合对带叶兜兰组培苗丛生芽诱导、增殖和幼苗生长的影响，筛选适合其诱导、增殖及壮苗生根的培养基组分，为规模化生产带叶兜兰组培苗提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
带叶兜兰蒴果采自广西河池天峨龙滩自然保护区。将带叶兜兰蒴果清洗干净，去除表面绒毛后用75%乙醇消毒1 min，5%次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗4次，剖开种皮后取出种子播种在花宝1号+1.0 g/L NH4NO3培养基上（图1-a），暗培养30 d后于25 ℃、光照强度2000 lx环境下培养60 d，然后选择生长健康、长势一致的无菌幼苗作为试验材料。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 丛生芽诱导和增殖培养 取具2～3片叶且无根或极少根的兜兰小植株，以RE、花宝（1.5 g/L花宝1号+1.5 g/L花宝2号）、1/2MS及MS等4种培养基为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂和有机物，进行带叶兜兰丛生芽诱导及增殖培养的培养基筛选；以筛选出适宜兜兰丛生芽诱导的1/2MS培养基为基本培养基，设添加椰子汁（150.0 mL/L）和香蕉汁（100.0 g/L）两种添加物处理，以不添加附加物为对照（CK1），并设添加0.1 mg/L NAA配合0、1.5和3.0 mg/L 6-BA 3种浓度处理，筛选适宜丛生芽诱导的添加物和激素浓度。增殖阶段培养基采用适宜丛生芽诱导的1/2MS培养基，添加80.0 g/L香蕉汁，进一步通过添加不同种类和浓度植物激素，对丛生芽增殖情况进行比较，以不添加激素为对照（CK2），具体配方见表4。每处理15瓶，3次重复，诱导试验每瓶3株，90 d后以瓶为单位统计诱导率、增殖系数、黄化率、成活率和植株生长情况；增殖试验每瓶5丛，每丛2株，90 d后以瓶为单位统计增殖系数、芽株高和植株生长情况。诱导率、增殖系数、黄化率、成活率参考秦丽凤和石贵玉（2013）、叶维雁等（2015）、祝剑峰等（2015）的方法进行计算。 诱导率（%）=萌芽株数/接种总株数×100
增殖系数=增殖的新芽数/每瓶接入芽数
黄化率（%）=黄化株数/接种总株数×100
成活率（%）=成活株数/接种总株数×100
1. 2. 2 壮苗及生根培养 取具2～3片叶、2～3条根的兜兰植株，以RE、花宝（1.0 g/L花宝1号+1.0 g/L花宝2号）、花宝改良（1.0 g/L花宝1号+1.0 g/L花宝2号+MS培养基的有机、微量成分）、MS等4种培养基为基本培养基，分别添加1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA、2.0 g/L活性炭，筛选适宜兜兰壮苗和生根的基本培养基；以花宝改良为基本培养基，附加2.0 g/L活性炭，添加NAA和6-BA两種生长激素，筛选适宜壮苗生长的激素组合；以花宝改良为基本培养基，附加0、2.0和4.0 g/L活性炭，筛选适宜壮苗生长的活性炭浓度。每处理15瓶，每瓶3株，3次重复。90 d后以瓶为单位统计植株鲜重、叶长、叶宽、根系长度、新根数及生根率等生长指标。
生根率（%）=生根株数/接种总株数×100
1. 2. 3 培养条件 上述增殖培养基均添加4.8 g/L琼脂、20.0 g/L蔗糖；壮苗及生根培养基均添加5.0 g/L琼脂、30.0 g/L蔗糖、1.5 g/L蛋白胨、80.0 g/L香蕉汁；pH 5.8。培养条件为25 ℃，每天光照12 h，光照强度2000 lx，培养周期为90 d。其中，增殖期间先暗培养30 d，再转为光照培养。
1. 3 统计分析
试验数据利用Excel 2003和DPS 7.05进行统计分析。
2 结果与分析
2. 1 兜兰丛生芽的诱导和增殖
2. 1. 1 不同基本培养基对带叶兜兰丛生芽诱导的影响
由表1可知，不同基本培养基对带叶兜兰丛生芽诱导率存在差异，但整体诱导率不高，增殖系数较小。其中，在添加1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和2.0 g/L活性炭的4种基本培养基上，以1/2MS培养基的芽诱导率最高，为15.2%，花宝培养基的最低，为6.7%，二者间差异极显著（P<0.01，下同），且前者的丛生芽萌发最早，接种后20 d即出现芽萌动，芽长势旺盛，无黄化、变异及死亡等不良生长现象，后者植株的死亡率最高，达12.5%，与前者差异极显著。RE培养基诱导的丛生芽黄化率达15.1%，并伴少量植株死亡，MS培养基诱导的丛生芽植株也有死亡现象。说明1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭较适合作为带叶兜兰丛生芽诱导的培养基。
2. 1. 2 不同天然添加物对带叶兜兰丛生芽诱导的影响
由表2可知，在1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 2.0 g/L活性炭基础上添加椰子汁的培养基中带叶兜兰丛生芽诱导率较高，为22.1%，与添加香蕉汁的诱导率（20.5%）差异显著（P<0.05，下同），植株鲜绿，偶见黄化和芽死亡，而添加香蕉汁培养基中芽的增殖系数较大，达1.34，极显著大于添加椰子汁的培养基及CK1，植株无黄化现象，但植株会偶发变异。丛生芽诱导出芽成活率以添加香蕉汁的培养基较高，但与添加椰子汁培养基及CK1的差异不显著（P>0.05，下同）。因此，1/2MS+ 1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁适宜作为带叶兜兰丛生芽诱导的培养基。
2. 1. 3 不同浓度6-BA对带叶兜兰丛生芽诱导的影响
由表3可知，在添加0.1 mg/L NAA的条件下，随着6-BA用量的增加，带叶兜兰丛生芽的诱导效果得到明显改善。其中，添加3.0 mg/L 6-BA的培养基带叶兜兰丛生芽诱导率为36.1%，极显著高于添加0～1.5 mg/L 6-BA的培养基；增殖系数为1.47，比添加0～1.5 mg/L 6-BA的培养基提高了42.7%和21.5%，且无植株黄化，该培养基上诱导的丛生芽成活率高，生长旺盛，叶片油绿（图1-b）。说明可将2.1.2中适宜带叶兜兰丛生芽诱导的培养基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁调整为1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+80.0 mL/L香蕉汁。
2. 1. 4 不同激素组合对带叶兜兰丛生芽增殖的影响
为扩大诱导获得的丛生芽数量，在增殖培养中进一步调整激素种类和用量以筛选最佳增殖培养基组分。由表4可知，在1/2MS培养基中添加不同激素种类和用量的带叶兜兰丛生芽增殖系数差异不显著，其中，添加TDZ和2，4-D处理的增殖系数较大，其次是添加NAA和6-BA处理，但丛生芽偶见变异，添加KT处理的增殖系数较小。在添加TDZ和2，4-D的处理中，以添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D为最适的带叶兜兰丛生芽增殖激素组合，无植株死亡，增殖系数达2.02，平均芽株高1.83 cm，极显著高于除3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA外的其他处理；TDZ浓度增加至0.3 mg/L或2，4-D浓度减少至1.0 mg/L均会极显著抑制新芽的生长发育；添加0.1 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D处理的增殖系数达1.92，平均芽株高1.63 cm，极显著高于CK2，新芽叶油绿、长势较好，仍可用于进行带叶兜兰丛生芽增殖；添加5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA处理的增殖系数为1.83，也可用于带叶兜兰丛生芽增殖，但芽株高较矮，为1.43 cm；添加3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA处理的增殖系数为1.53，但芽生长较好，株高（1.73 cm）显著高于CK2，亦可用于带叶兜兰丛生芽增殖。添加KT处理的丛生芽增殖系数小，尤其是添加1.0 mg/L KT处理，芽极矮小，生长较弱，不宜用于带叶兜兰丛生芽增殖。 2. 2 兜兰丛生芽增殖苗的壮苗和生根培养
2. 2. 1 不同基本培养基对带叶兜兰增殖苗壮苗和生根的影响 由表5可知，在添加1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA及80.0 g/L香蕉汁的4种基本培养基上，带叶兜兰增殖苗均能正常生长，培养到120 d时，4种基本培养基上增殖苗的鲜重间及叶片长度间差异不显著；增殖苗在花宝改良培养基上生长效果最佳，植株叶片宽展，浓绿有光泽，根系发达，新根萌发多且长，生根率达75.5%，极显著高于其他处理，新根萌发数分别比MS、RE和花宝培养基提高94.3%、54.5%和61.9%，差异显著；根系长度比RE、花宝及MS培养基分别提高197.4%、175.6%和264.5%，且差异极显著。此外，花宝改良培养基的叶片宽比花寶培养基提高20.0%，差异显著。在RE和MS培养基上，带叶兜兰叶片失绿较明显，叶色暗淡，尤其是在MS培养基上，叶片出现白化现象较多，且叶细长，生根率仅58.1%，极显著低于RE和花宝改良培养基，显著低于花宝培养基。
可见，花宝改良培养基有利于兜兰幼苗叶幅增大、新根萌发和伸长，促进幼苗地上部分和地下部分协同增长，花宝、RE和MS培养基增殖苗的生长情况依次变差，说明低盐培养基更适合于带叶兜兰的壮苗培养，丰富的微量和有机元素能有效促进兜兰组培苗对营养物质的吸收和生物量的积累（图1-c）。
2. 2. 2 不同生长激素对带叶兜兰幼苗壮苗和生根的影响 由表6可知，在添加了香蕉汁和活性炭的花宝改良培养基上，添加生长激素NAA和6-BA对带叶兜兰幼苗的生物量、叶片宽度和生根率均有一定的提高作用。其中，添加1.0 mg/L NAA培养基中幼苗的长势最佳，主要表现在鲜重增加明显、叶片宽大平展及根系粗壮等方面，尤其是鲜重和叶片宽度显著或极显著高于不添加NAA或添加NAA+6-BA的培养基。在生根率方面，添加NAA的培养基比不添加NAA的培养基提高35.2%，差异显著，与添加NAA+6-BA的培养基差异不显著。因此，添加1.0 mg/L NAA能较好地促进带叶兜兰幼苗生长，但结合0.1 mg/L 6-BA使用后，兜兰地上部分生长量较小，说明6-BA在一定程度上弱化了NAA促进兜兰生长的作用。
2. 2. 3 不同浓度活性炭对带叶兜兰壮苗和生根的影响 由表7可知，在花宝改良培养基中添加活性炭可促进带叶兜兰组培苗生根，促进根的生长和新根的分化，且对幼苗的生物量积累和叶面积增大产生了良好的促进作用，其中，以添加2.0 g/L活性炭幼苗的长势较佳，鲜重比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分别提高62.5%和30.0%，差异达极显著或显著水平；叶片长度比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分别提高24.1%和16.0%，差异均达极显著或显著水平；根系长度比不添加活性炭及添加4.0 g/L活性炭分别提高117.6%和37.0%，差异极显著或显著；生根率比不添加活性炭提高74.4%，差异极显著，但与添加4.0 g/L活性炭差异不显著。说明活性炭不仅为根的生长提供了较好的暗环境，还能吸附一部分幼苗生长过程中产生的代谢物和有毒物质。因此，添加2.0 g/L活性炭的培养基较适宜带叶兜兰壮苗生长，组培苗移栽后较易成活（图1-d）。
3 讨论
带叶兜兰是介于附生与地生间的兰科植物，离体培养过程中试管苗发育较缓慢，一定时间内的繁育数量受限，移栽难度较大，通过组织培养方法进行其丛生芽增殖和培育壮苗是快速扩大组培苗数量和促进组培苗移栽成活的重要措施。兜兰的试管成苗过程受兜兰种类、外植体种类、光照时间、培养基种类、有机添加物类型等条件影响（Pierik et al.，1988；Zeng et al.，2011，2012）。本研究结果表明，1/2MS培养基对带叶兜兰的增殖效果较佳，丛生芽萌动早，新芽质量好且生长量大，而其他培养基会出现芽死亡或黄化现象，说明降低培养基的无机盐浓度有利于兜兰丛生芽的诱导，与杨燕萍等（2011）对亨利兜兰的研究结果相似。李慧敏等（2013）研究发现，培养基中天然有机添加物含有氨基酸、激素、酶等多种复杂成分，能促进白芨组培苗的增殖分化和生长，本研究结果与其相似，添加适量香蕉汁可有效提高兜兰的丛生芽增殖率。本研究发现，培养基中添加3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA对兜兰丛生芽诱导有较好的促进作用，丛生芽生长旺盛，无死亡或变异，增殖培养以添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D的效果较好，无植株死亡，芽生长量大，但兜兰丛生芽的增殖系数整体偏小，最大的仅2.02，明显小于丁长春和夏念和（2009）对麻栗坡兜兰、杨燕萍等（2011）对亨利兜兰丛生芽的增殖系数，其原因除了与所使用的兜兰种类、激素浓度和配比不同有关外，还可能与本研究使用的材料数量有限、尤其是诱导阶段每瓶内接种植株数量较少且为单植（带叶兜兰是群居性兰花）有关。本研究增殖培养中添加TDZ和2，4-D培养基虽可增殖丛生芽数量，但增殖系数增加有限，未产生多芽丛植的群聚效应。崔秋华等（2012）对齿瓣石斛丛生芽增殖的研究也认为，随着丛植芽数量的增多，增殖系数逐渐提高，5株一丛时有利于芽的增殖和生长。
组培苗生长健壮有利于移栽后缩短缓苗时间，提高其对外界环境的适应能力和抵抗能力。已有的研究表明，低盐浓度培养基适合多数兜兰组培苗的生长发育，高盐浓度培养基则抑制其幼苗的生长，但不同兜兰种类有其最适宜的培养基类型，如带叶兜兰（曾宋君等，2006）、麻栗坡兜兰（丁长春和夏念和，2009）和亨利兜兰（杨燕萍等，2011）等在花宝培养基上的壮苗生根效果较好，而报春兜兰适合在RE培养基中培育壮苗（周丽等，2013），小叶兜兰在1/2MS培养基上生长旺盛（尤佳妍等，2014）。本研究中使用的花宝改良培养基含盐量低，氮、磷、钾比例更适合培育带叶兜兰壮苗的需求，配合MS培养基中的有机及微量元素成分使用，兜兰植株叶幅增大，根系发达，能明显促进组培苗出瓶移栽成活。本研究采用NAA 1.0 mg/L即可较好地促进带叶兜兰幼苗生长，与丁长春和夏念和（2009）对多种兜兰、周丽等（2013）对报春兜兰、田凡等（2014）对白花兜兰、尤佳妍等（2014）对小叶兜兰的壮苗和生根研究结果相似。 活性炭具有强大的吸附能力，可吸附培养物在代谢过程中产生的有害物质，同时有利于根的向地性生长，在兜兰种子苗培养过程中还可防止酚污染和变褐老化，促进器官形成，减少玻璃化（陈宇勒，2009）。陈尔等（2014）和田凡等（2014）研究认为适量的活性炭对春兰及白花兜兰根的生长发育有重要作用。本研究设3个浓度活性炭添加量处理，结果发现以添加2.0 g/L的壮苗和生根效果最好，与曾宋君等（2006）、尤佳妍等（2014）的研究结果一致。
4 结论
在1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭培养基中添加香蕉汁较适宜带叶兜兰丛生芽诱导和增殖培养；在1/2MS+80.0 g/L香蕉汁培养基中添加0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2，4-D有助于提高带叶兜兰的增殖系数；花宝改良培养基适宜带叶兜兰壮苗培养，结合添加NAA和活性炭使用，生根效果更佳，但活性炭浓度不易过高。
参考文献：
陈尔，王华新，陈宝玲，农凤梅，李冰，苏莉花. 2014. 春兰根状茎增殖的影响因素[J]. 广西林业科学，43（3）：319-321.
Chen E，Wang H X，Chen B L，Nong F M，Li B，Su L H. 2014. Influence factors of Cymbidium goeringii rhizomes multiplication[J]. Guangxi Forestry Science，43（3）：319-321.
陈宇勒. 2009. 兰花繁育技术图解[M]. 广州：广东科技出版社.
Chen Y L. 2009. Orchid Breeding Technology Illustration[M]. Guangzhou：Guangdong Science and Technology Publishing House.
陈之林，叶秀粦，梁承邺，段俊. 2004. 杏黄兜兰和硬叶兜兰的种子试管培养[J]. 园艺学报，31（4）：540-542.
Chen Z L，Ye X L，Liang C Y，Duan J. 2004. Seed germination in vitro of Paphiopedilum armeniacum and P. micranthum[J]. Acta Horticulturae Sinica，31（4）：540-542.
崔秋华，孙永玉，李昆，周志美，段明伦. 2012. 不同因子对齿瓣石斛增殖系数和平均苗高的影响[J]. 中南林业科技大学学报，32（4）：200-203.
Cui Q H，Sun Y Y，Li K，Zhou Z M，Duan M L. 2012. Effects of different factors on proliferation coefficient of Dendrobium devonianum and average seedling height[J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology，32（4）：200-203.
丁長春，夏念和. 2009. 麻栗坡兜兰的无菌播种与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，45（2）：1201-1202.
Ding C C，Xia N H. 2009. Aseptic sowing and rapid propagation of Paphiopedilum malipoense S. C. Chen & Z. H. Tsi in vitro[J]. Plant Physiology Communications，45（2）：1201-1202.
丁长春，虞泓，刘方媛. 2004. 影响杏黄兜兰种子萌发的因素[J]. 云南植物研究，26（6）：673-677.
Ding C C，Yu H，Liu F Y. 2004. Factors affecting the germination of Paphiopedilum armeniacum[J]. Acta Botanica Yunnanica，26（6）：673-677.
李慧敏，杨冠海，李明静，闻永慧，张青华，李枝林. 2013. 白芨瓶内假鳞茎诱导研究[J]. 南方农业学报，44（10）：1607-1612.
Li H M，Yang G H，Li M J，Wen Y H，Zhang Q H，Li Z L. 2013. Bletilla striata pseudobulb induction in bottle[J]. Journal of Southern Agriculture，44（10）：1607-1612.
刘仲健，刘可为，陈利君，雷嗣鹏，李利强，施晓春，黄来强. 2006. 濒危物种杏黄兜兰的保育生态学[J]. 生态学报，26（9）：2791-2800.
Liu Z J，Liu K W，Chen L J，Lei S P，Li L Q，Shi X C，Huang L Q. 2006. Conservation ecology of endangered species Paphiopedilum armeniacum（Orchidaceae）[J]. Acta Ecologica Sinica，26（9）：2791-2800.
罗毅波，贾建生，王春玲. 2003. 初论中国兜兰属植物的保护策略及其潜在资源优势[J]. 生物多样性，11（6）：491-498.
Luo Y B，Jia J S，Wang C L. 2003. Conservation strategy and potential advantages of the Chinese Paphiopedilum[J]. Biodiversity Science，11（6）：491-498. 秦丽凤，石贵玉. 2013. 外源激素对杂交兰组培快繁的效应[J]. 南方农业学报，44（9）：1435-1438.
Qin L F，Shi G Y. 2013. Effects of exogenous growth regulators on rapid propagation of Cymbidium hybridum×Faberi[J]. Journal of Southern Agriculture，44（9）：1435-1438.
史军，程瑾，罗敦，上官法治，罗毅波. 2007. 利用传粉综合征预测：长瓣兜兰模拟繁殖地欺骗雌性食蚜蝇传粉[J]. 植物分类学报，45（4）：551-560.
Shi J，Cheng J，Luo D，Shangguan F Z，Luo Y B. 2007. Pollination syndromes predict brood-site deceptive pollination by female hoverflies in Paphiopedilum dianthum（Orchidaceae）[J]. Acta Phytotaxonomica Sinica，45（4）：551-560.
孙晓颖. 2014. 五种野生兜兰植物菌根真菌多样性研究[D]. 北京：北京林业大学.
Sun X Y. 2014. Diversity of mycorrhizal fungi isolated from five species of the genus Paphiopedilum[D]. Beijing：Beijing Forestry University.
田凡，姜运力，罗在柒，王莲辉. 2014. 白花兜兰种子无菌萌发及试管成苗技术研究[J]. 贵州林业科技，42（3）：34-38.
Tian F，Jiang Y L，Luo Z Q，Wang L H. 2014. Asymbiotic germination and in vitro seedling cultivation of Paphiopedilum emersonii[J]. Guizhou Forestry Science and Technology，42（3）：34-38.
杨燕萍，徐晓薇，姚丽娟，林霞，张庆良，张旭乐，黄建. 2011. 亨利兜兰茎尖诱导与离体快繁试验[J]. 农业科技通讯，（4）：53-55.
Yang Y P，Xu X W，Yao L J，Lin X，Zhang Q L，Zhang X L，Huang J. 2011. Shoot tips culture and in vitro propagation of Paphiopedilum henryanum[J]. Bulletin of Agricultural Science and Technology，（4）：53-55.
叶维雁，郭晓月，刘惠民，王连春，刘鹏，吴海波. 2015. 葡萄柚种子无菌苗组培快繁体系的建立[J]. 广西植物，35（6）：891-898.
Ye W Y，Guo X Y，Liu H M，Wang L C，Liu P，Wu H B. 2015. Establishment of rapid propagation for sterile seedlings of grapefruit by tissue culture[J]. Guihaia，35（6）：891-898.
尤佳妍，张毓，刘岩，程瑾，潘会堂，张启翔. 2014. 小叶兜兰的种子发育和无菌萌发[J]. 植物生理学报，50（3）：275-282.
You J Y，Zhang Y，Liu Y，Cheng J，Pan H T，Zhang Q X. 2014. Seed development and asymbiotic germination of Paphiopedilum barbigerum Tang et Wang[J]. Plant Physiology Journal，50（3）：275-282.
張娟娟，严宁，胡虹. 2013. 三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系[J]. 植物分类与资源学报，35（1）：33-40.
Zhang J J，Yan N，Hu H. 2013. The seed development of three Paphiopedilum species in relation to asymbiotic germination[J]. Plant Diversity and Resources，35（1）：33-40.
曾宋君，陈之林，段俊. 2006. 带叶兜兰的无菌播种和离体快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，42（2）：247.
Zeng S J，Chen Z L，Duan J. 2006. Asepsis sowing and in vitro propagation of Paphiopedilum hirsutissimum Pfitz[J]. Plant Physiology Communications，42（2）：247.
曾宋君，陈之林，吴坤林，段俊. 2007. 兜兰无菌播种和组织培养研究进展[J]. 园艺学报，34（3）：793-796.
Zeng S J，Chen Z L，Wu K L，Duan J. 2007. A resume of germination and mericlone of Paphiopedilum[J]. Acta Horticulturae Sinica，34（3）：793-796. 周丽，邓克云，徐正海. 2013. “金州报春”兜兰的非共生萌发与快速繁殖[J]. 植物生理学报，49（11）：1250-1254.
Zhou L，Deng K Y，Xu Z H. 2013. In vitro asymbiotic germination and propagation of Paphiopedilum primulinum ‘Jinzhou-
baochun’[J]. Plant Physiology Journal，49（11）：1250-1254.
祝剑峰，李芬，袁宇明，王丽珍. 2015. 鸢尾组织培养快速繁殖技术研究[J]. 江西农业学报，27（5）：25-28.
Zhu J F，Li F，Yuan Y M，Wang L Z. 2015. Research on tissue culture and rapid propagation of Iris[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（5）：25-28.
Pierik R L M，Sprenkels P A，Van Der Harst B，Van Der Meys Q G. 1988. Seed germination and further development of plantlets of Paphiopedilum ciliolare Pfitz. in vitro[J]. Scien-
tia Horticulturae，34（1）：139-153.
Zeng S J，Chen Z L，Wu K L，Zhang J X，Bai C K，Da Silva J A T，Duan J，Zeng S J. 2011. Asymbiotic seed germination，induction of calli and protocorm-like bodies，and in vitro seedling development of the rare and endangered Nothodoritis zhejiangensis Chinese orchid[J]. Hort Science，46（3）：460-465.
Zeng S J，Wu K L，Teixeira da silva J A，Zhang J X，Chen Z L，Xia N H，Duan J. 2012. Asymbiotic seed germination，seedling development and reintroduction of Paphiopedilum wardii Sumerh，an endangered terrestrial orchid[J]. Scientia Horticulturae，138（5）：198-209.
（責任编辑 思利华）