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摘要 [目的]研究火炭母水提液的体内及体外抗氧化活性。[方法]采用体外试验测定火炭母水提液对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力;体内试验以秀丽隐杆线虫为模型，测定火炭母水提液对线虫寿命和应激损伤的影响。[结果]火炭母水提液对超氧阴离子自由基和羟基自由基具有一定的清除能力，并且随着浓度的增加，自由基清除率逐渐增强;50 mg/mL火炭母水提液可以显著延长线虫寿命，并且提高线虫在急性热应激和氧化应激条件下的存活率。[结论]火炭母水提液具有良好的抗氧化活性，该研究为火炭母开发成为天然抗氧化剂和保健产品提供理论基础。
关键词 火炭母;水提液;体内外;抗氧化活性;秀丽隐杆线虫
中图分类号 R-284.1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）13-0184-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.046
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on Antioxidant Activity of Polygonum chinese L.Water Extracts in vitro and in vivo
YANG Ai hua，SONG Shan shan，LIN Yu jie et al
（College of Basic Medical Sciences，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000）
Abstract [Objective]To study the antioxidant activity of Polygonum chinese L.water extracts in vitro and in vivo.[Method]The in vitro test was used to determine the scavenging ability of the Polygonum chinese water extract on superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals.In vivo，Caenorhabditis elegans were used to study the effects of Polygonum chinese water extracts on lifespan，hot stress and oxidative stress.[Result]The water extract of Polygonum chinese had a certain scavenging ability to superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals，and as the concentration increases，the free radical scavenging rate gradually increased.The treatment with 50 mg/mL Polygonum chinese water extracts could increase the lifespan，and obviously improve the survival rate of C.elegans under hot stress and oxidative stress.[Conclusion]The water extract of Polygonum chinese has good antioxidant activity.This study provides a theoretical basis for the development of Polygonum chinese as a natural antioxidant and health care product.
Key words Polygonum chinese L.;Water extracts;In vitro and in vivo;Antioxidant activity;Caenorhabditis elegans
机体正常的代谢活动会产生自由基，正常情况下自由基的产生与清除会处于一种动态平衡状态，但当体内自由基积累过多或机体抗氧化机能下降，过量的自由基会造成过氧化反应的发生并加速组织功能的损伤，此类氧化损伤也是造成肿瘤等疾病及机体衰老的原因之一[1-2]。因此，人们将关注点转向具有良好抗氧化活性的天然产物，而中药因其成分天然、整体均衡调节和毒副作用小等优点受到广泛关注[3]。火炭母（Polygonum chinese L.）为蓼科蓼属植物，是民间常见的中草药，曾被收录于1977年版《中华人民共和国药典》、2004年《广东省药材地方标准》、2014年《广西壮族自治区瑶药材质量标准 第一卷》[4-6]，具有清热除湿、凉血解毒、利肝明目、活血舒筋等功效[7]。研究表明，火炭母提取物具有抗炎镇痛、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等药理作用[8-12]。因此，火炭母在养生保健和臨床治疗方面具有一定的开发价值。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有易培养、寿命短、便于观察及全基因组序列明确等优点，是中药研究领域的常用模式生物[13-14]。该研究采用体外和体内相结合的方法，探讨火炭母水提液对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力，并以秀丽隐杆线虫为模型，观察火炭母水提液对线虫寿命和应激损伤的影响，以期为火炭母资源的深入开发与应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 1.1.1 试材。火炭母，购于本地中药市场;大肠杆菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），由遵义医科大学微免实验室保存。
1.1.2 试剂。LB液体培养基、胰蛋白胨、琼脂粉，广东环凯微生物科技有限公司;氯化钠、氯化钙、磷酸钾、无水硫酸镁，均为分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司;胆固醇、硫酸链霉素、制霉菌素、5-FuDR （5-氟尿嘧啶脱氧核苷），北京索来宝科技有限公司。
1.1.3 设备。高速离心机（TD5M-WS），上海卢湘仪离心机仪器有限公司;酶标仪（ELx800），美国博腾仪器有限公司;电热鼓风干燥箱（101-2AB），天津市泰斯特仪器有限公司;超净工作台（BCM-1000A），苏州安泰空气技术有限公司;恒温水浴锅（HH·W21·600S）、电热恒温培养箱（HH-B11·600BY），上海跃进医疗器械有限公司;体视显微镜（MZ62-3D），广州市明美广电技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 火炭母水提液制备。
火炭母粉碎过40目筛备用，称取火炭母粉末按1∶10的料液比加水浸泡30 min，加热煮沸1 h，过滤并收集滤液。药渣加水再提取1次，合并2次滤液，5 000 r/min 离心10 min，过滤取上清液。滤液加热浓缩制成浓度为1 g/mL的火炭母提取液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 火炭母水提液体外抗氧化活性测定。
将火炭母水提液配制为不同浓度样品溶液，以VC作为阳性对照，分别采用邻苯三酚自氧化法测定超氧阴离子自由基清除作用、水杨酸法测定羟基自由基清除作用[15]。
1.2.3 火炭母水提液体内抗氧化活性测定。
1.2.3.1 线虫培养及同步化。参照文献方法配制NGM培养基[16]，使用时以LB液体培养基培养OP50大肠杆菌，然后将菌液涂布在 NGM 培养基表面，37 ℃过夜培养后使用。选取线虫生长良好的NGM平板，用M9缓冲液将线虫冲洗收集于无菌离心管中，反复离心清洗后弃上清，加入裂解液（1 mol/L NaOH 与10% NaClO等体积混合，现配现用）混匀，涡旋振荡5～8 min后离心弃上清得虫卵。将虫卵置于M9缓冲液中，20 ℃培养箱放置过夜，得到L1期幼虫。将幼虫转移置NGM平板，20 ℃培养箱培养48 h，此时即得L4期线虫。
1.2.3.2 线虫暴露处理方法。取同步化后的L4期成虫，对照组加入M9缓冲液，试验组以火炭母水提液处理线虫24 h，用M9缓冲液清洗并收集于无菌EP 管中，反复离心洗涤，用于后续各试验的测定。
1.2.3.3 线虫寿命试验。取经火炭母提取液暴露处理24 h后的线虫，每个平板约20条线虫，20 ℃培养。从转移当天（寿命试验当天）起计算线虫存活天数，以铂金丝碰触线虫仍然不动即判定为死亡，每隔2 d记录线虫存活和死亡条数，直至线虫全部死亡。
1.2.3.4 线虫急性热应激试验。取经火炭母提取液暴露处理24 h后的线虫，每个平板约20条线虫，将平板转移置37 ℃培养箱中培养，每隔1 h 记录线虫存活数目，直至线虫全部死亡。
1.2.3.5 线虫急性氧化应激试验。取经火炭母提取液暴露处理24 h后的线虫加入12孔板中，每孔约20条线虫。每孔中含有2 mL新鲜配制的0.03%过氧化氢溶液，每隔1 h 记录线虫存活数目，直至线虫全部死亡。
1.3 数据处理
试验结果以 Excel 2010、SPSS 22.0 统计软件进行绘图及统计分析。
2 结果与分析
2.1 火炭母水提液的体外抗氧化活性
2.1.1 火炭母水提液对超氧阴离子自由基的清除作用。超氧阴离子在体内的积累是机体引发氧中毒的主要原因，因此，超氧阴离子的清除能力是体外抗氧化活性试验中的一个重要指标[17]。由图1可知，火炭母水提液对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，随着浓度的增加，清除率逐渐升高，在试验浓度范围内的最大清除率达35.79%。但在相同浓度情况下，火炭母水提液清除超氧阴离子自由基的能力始终低于抗坏血酸（VC）。
2.1.2 火炭母水提液對羟基自由基的清除作用。
机体内羟基自由基能够衍生为多种氧自由基，并快速与细胞分子发生反应，造成机体的多种损伤，是加速衰老及疾病发生的重要原因[18]。由图2可知，火炭母水提液对羟基自由基具有一定的清除能力，随着浓度的增加，清除率逐渐升高，并在50 mg/mL 时与同浓度条件下VC的清除效果相当。
2.2 火炭母水提液的体内抗氧化活性
2.2.1 火炭母水提液对线虫寿命的影响。
正常培养情况下，秀丽线虫的寿命为14～21 d[19-20]。由图3和表1可知，50 mg/mL 火炭母水提液对线虫寿命有显著的促进作用（P<0.05），火炭母水提液处理后的线虫最长寿命为20 d，明显高于对照组，并且对照组线虫的平均寿命为（9.63±0.92）d，用火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了16.61%。
2.2.2 火炭母水提液对热应激条件下线虫寿命的影响。
由图4和表2可知，将秀丽线虫置于37 ℃培养条件下，经50 mg/mL火炭母水提液处理后的线虫在热应激条件下的存活率得到显著提高（P<0.05）。此时对照组线虫的平均寿命为（3.41±0.32）h，用火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了17.88%。
2.2.3 火炭母水提液对氧化应激条件下线虫寿命的影响。
由图5和表3可知，将秀丽线虫置于0.03%过氧化氢溶液中造成氧化损伤，经50 mg/mL火炭母水提液处理后的试验组线虫的存活率显著提高（P<0.05）。此时对照组线虫的平均寿命为（2.68±0.29）h，用火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了20.52%。 3 讨论与结论
抗氧化剂能够清除机体内积累过多的自由基，在维持正常生命活动及保持身体健康方面起着重要作用。随着年龄增长或体内抗氧化剂不足时，摄入功能性的抗氧化食品也可以起到补充体内抗氧化剂的作用。研究表明，广东凉茶之所以具有清热解毒、下火祛湿等功效，原因可能来自其原料中多种中草药含有的活性物质[21-23]。火炭母作为广东凉茶的主要原料之一，富含多酚、多糖及黄酮类物质，可以作为天然抗氧剂的重要来源。该研究以火炭母水提液为对象，对其进行体外抗氧化活性及秀丽线虫体内的抗氧化活性研究。体外试验结果表明，火炭母水提液对超氧阴离子自由基和羟基自由基具有一定的清除能力，随着浓度的增加，自由基清除率逐渐增强，并且在相同浓度条件下，火炭母水提液对羟基自由基清除效果更好。体内试验结果表明，经50 mg/mL火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了16.61%，同时，在急性应激条件下火炭母水提液对秀丽线虫具有一定的保护作用。由此可见，火炭母水提液具有良好的抗氧化活性，在天然抗氧化剂的开发方面具有潜在的应用价值。
参考文献
[1]
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关键词 火炭母;水提液;体内外;抗氧化活性;秀丽隐杆线虫
中图分类号 R-284.1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）13-0184-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.046
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on Antioxidant Activity of Polygonum chinese L.Water Extracts in vitro and in vivo
YANG Ai hua，SONG Shan shan，LIN Yu jie et al
（College of Basic Medical Sciences，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000）
Abstract [Objective]To study the antioxidant activity of Polygonum chinese L.water extracts in vitro and in vivo.[Method]The in vitro test was used to determine the scavenging ability of the Polygonum chinese water extract on superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals.In vivo，Caenorhabditis elegans were used to study the effects of Polygonum chinese water extracts on lifespan，hot stress and oxidative stress.[Result]The water extract of Polygonum chinese had a certain scavenging ability to superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals，and as the concentration increases，the free radical scavenging rate gradually increased.The treatment with 50 mg/mL Polygonum chinese water extracts could increase the lifespan，and obviously improve the survival rate of C.elegans under hot stress and oxidative stress.[Conclusion]The water extract of Polygonum chinese has good antioxidant activity.This study provides a theoretical basis for the development of Polygonum chinese as a natural antioxidant and health care product.
Key words Polygonum chinese L.;Water extracts;In vitro and in vivo;Antioxidant activity;Caenorhabditis elegans
机体正常的代谢活动会产生自由基，正常情况下自由基的产生与清除会处于一种动态平衡状态，但当体内自由基积累过多或机体抗氧化机能下降，过量的自由基会造成过氧化反应的发生并加速组织功能的损伤，此类氧化损伤也是造成肿瘤等疾病及机体衰老的原因之一[1-2]。因此，人们将关注点转向具有良好抗氧化活性的天然产物，而中药因其成分天然、整体均衡调节和毒副作用小等优点受到广泛关注[3]。火炭母（Polygonum chinese L.）为蓼科蓼属植物，是民间常见的中草药，曾被收录于1977年版《中华人民共和国药典》、2004年《广东省药材地方标准》、2014年《广西壮族自治区瑶药材质量标准 第一卷》[4-6]，具有清热除湿、凉血解毒、利肝明目、活血舒筋等功效[7]。研究表明，火炭母提取物具有抗炎镇痛、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等药理作用[8-12]。因此，火炭母在养生保健和臨床治疗方面具有一定的开发价值。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）具有易培养、寿命短、便于观察及全基因组序列明确等优点，是中药研究领域的常用模式生物[13-14]。该研究采用体外和体内相结合的方法，探讨火炭母水提液对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力，并以秀丽隐杆线虫为模型，观察火炭母水提液对线虫寿命和应激损伤的影响，以期为火炭母资源的深入开发与应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 1.1.1 试材。火炭母，购于本地中药市场;大肠杆菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），由遵义医科大学微免实验室保存。
1.1.2 试剂。LB液体培养基、胰蛋白胨、琼脂粉，广东环凯微生物科技有限公司;氯化钠、氯化钙、磷酸钾、无水硫酸镁，均为分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司;胆固醇、硫酸链霉素、制霉菌素、5-FuDR （5-氟尿嘧啶脱氧核苷），北京索来宝科技有限公司。
1.1.3 设备。高速离心机（TD5M-WS），上海卢湘仪离心机仪器有限公司;酶标仪（ELx800），美国博腾仪器有限公司;电热鼓风干燥箱（101-2AB），天津市泰斯特仪器有限公司;超净工作台（BCM-1000A），苏州安泰空气技术有限公司;恒温水浴锅（HH·W21·600S）、电热恒温培养箱（HH-B11·600BY），上海跃进医疗器械有限公司;体视显微镜（MZ62-3D），广州市明美广电技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 火炭母水提液制备。
火炭母粉碎过40目筛备用，称取火炭母粉末按1∶10的料液比加水浸泡30 min，加热煮沸1 h，过滤并收集滤液。药渣加水再提取1次，合并2次滤液，5 000 r/min 离心10 min，过滤取上清液。滤液加热浓缩制成浓度为1 g/mL的火炭母提取液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 火炭母水提液体外抗氧化活性测定。
将火炭母水提液配制为不同浓度样品溶液，以VC作为阳性对照，分别采用邻苯三酚自氧化法测定超氧阴离子自由基清除作用、水杨酸法测定羟基自由基清除作用[15]。
1.2.3 火炭母水提液体内抗氧化活性测定。
1.2.3.1 线虫培养及同步化。参照文献方法配制NGM培养基[16]，使用时以LB液体培养基培养OP50大肠杆菌，然后将菌液涂布在 NGM 培养基表面，37 ℃过夜培养后使用。选取线虫生长良好的NGM平板，用M9缓冲液将线虫冲洗收集于无菌离心管中，反复离心清洗后弃上清，加入裂解液（1 mol/L NaOH 与10% NaClO等体积混合，现配现用）混匀，涡旋振荡5～8 min后离心弃上清得虫卵。将虫卵置于M9缓冲液中，20 ℃培养箱放置过夜，得到L1期幼虫。将幼虫转移置NGM平板，20 ℃培养箱培养48 h，此时即得L4期线虫。
1.2.3.2 线虫暴露处理方法。取同步化后的L4期成虫，对照组加入M9缓冲液，试验组以火炭母水提液处理线虫24 h，用M9缓冲液清洗并收集于无菌EP 管中，反复离心洗涤，用于后续各试验的测定。
1.2.3.3 线虫寿命试验。取经火炭母提取液暴露处理24 h后的线虫，每个平板约20条线虫，20 ℃培养。从转移当天（寿命试验当天）起计算线虫存活天数，以铂金丝碰触线虫仍然不动即判定为死亡，每隔2 d记录线虫存活和死亡条数，直至线虫全部死亡。
1.2.3.4 线虫急性热应激试验。取经火炭母提取液暴露处理24 h后的线虫，每个平板约20条线虫，将平板转移置37 ℃培养箱中培养，每隔1 h 记录线虫存活数目，直至线虫全部死亡。
1.2.3.5 线虫急性氧化应激试验。取经火炭母提取液暴露处理24 h后的线虫加入12孔板中，每孔约20条线虫。每孔中含有2 mL新鲜配制的0.03%过氧化氢溶液，每隔1 h 记录线虫存活数目，直至线虫全部死亡。
1.3 数据处理
试验结果以 Excel 2010、SPSS 22.0 统计软件进行绘图及统计分析。
2 结果与分析
2.1 火炭母水提液的体外抗氧化活性
2.1.1 火炭母水提液对超氧阴离子自由基的清除作用。超氧阴离子在体内的积累是机体引发氧中毒的主要原因，因此，超氧阴离子的清除能力是体外抗氧化活性试验中的一个重要指标[17]。由图1可知，火炭母水提液对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，随着浓度的增加，清除率逐渐升高，在试验浓度范围内的最大清除率达35.79%。但在相同浓度情况下，火炭母水提液清除超氧阴离子自由基的能力始终低于抗坏血酸（VC）。
2.1.2 火炭母水提液對羟基自由基的清除作用。
机体内羟基自由基能够衍生为多种氧自由基，并快速与细胞分子发生反应，造成机体的多种损伤，是加速衰老及疾病发生的重要原因[18]。由图2可知，火炭母水提液对羟基自由基具有一定的清除能力，随着浓度的增加，清除率逐渐升高，并在50 mg/mL 时与同浓度条件下VC的清除效果相当。
2.2 火炭母水提液的体内抗氧化活性
2.2.1 火炭母水提液对线虫寿命的影响。
正常培养情况下，秀丽线虫的寿命为14～21 d[19-20]。由图3和表1可知，50 mg/mL 火炭母水提液对线虫寿命有显著的促进作用（P<0.05），火炭母水提液处理后的线虫最长寿命为20 d，明显高于对照组，并且对照组线虫的平均寿命为（9.63±0.92）d，用火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了16.61%。
2.2.2 火炭母水提液对热应激条件下线虫寿命的影响。
由图4和表2可知，将秀丽线虫置于37 ℃培养条件下，经50 mg/mL火炭母水提液处理后的线虫在热应激条件下的存活率得到显著提高（P<0.05）。此时对照组线虫的平均寿命为（3.41±0.32）h，用火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了17.88%。
2.2.3 火炭母水提液对氧化应激条件下线虫寿命的影响。
由图5和表3可知，将秀丽线虫置于0.03%过氧化氢溶液中造成氧化损伤，经50 mg/mL火炭母水提液处理后的试验组线虫的存活率显著提高（P<0.05）。此时对照组线虫的平均寿命为（2.68±0.29）h，用火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了20.52%。 3 讨论与结论
抗氧化剂能够清除机体内积累过多的自由基，在维持正常生命活动及保持身体健康方面起着重要作用。随着年龄增长或体内抗氧化剂不足时，摄入功能性的抗氧化食品也可以起到补充体内抗氧化剂的作用。研究表明，广东凉茶之所以具有清热解毒、下火祛湿等功效，原因可能来自其原料中多种中草药含有的活性物质[21-23]。火炭母作为广东凉茶的主要原料之一，富含多酚、多糖及黄酮类物质，可以作为天然抗氧剂的重要来源。该研究以火炭母水提液为对象，对其进行体外抗氧化活性及秀丽线虫体内的抗氧化活性研究。体外试验结果表明，火炭母水提液对超氧阴离子自由基和羟基自由基具有一定的清除能力，随着浓度的增加，自由基清除率逐渐增强，并且在相同浓度条件下，火炭母水提液对羟基自由基清除效果更好。体内试验结果表明，经50 mg/mL火炭母水提液处理后的线虫平均寿命延长了16.61%，同时，在急性应激条件下火炭母水提液对秀丽线虫具有一定的保护作用。由此可见，火炭母水提液具有良好的抗氧化活性，在天然抗氧化剂的开发方面具有潜在的应用价值。
参考文献
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