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摘要 [目的]筛选剁椒最佳发酵工艺。[方法]通过单因素分析和正交试验，对剁椒的发酵工艺进行优化。[结果]剁椒天然发酵的最优工艺为食盐添加量5%，白砂糖添加量5%，28 ℃发酵16 d。该发酵条件下，得到亚硝酸盐含量仅1.32 mg/kg、感官评分84分、品质佳的天然发酵剁椒产品。[结论]该研究可为发酵剁椒标准化与工业化生产提供理论依据。
关键词 剁椒;亚硝酸盐;感官评价;发酵工艺优化
中图分类号 TS255.5文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）10-0153-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.041
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Optimization of Fermentation Conditions for Natural Fermented Chopped Pepper
HUANG Wu-yu1， GONG Fu-ming2， HE Cai-mei1
（1. School of Food and Bioengineering， Hezhou University， Hezhou， Guangxi 542899;2. School of Basic Medical Sciences，Dehong Vocational College， Mangshi， Yunnan 678400）
Abstract [Objective]To screen the best fermentation technology of chopped pepper. [Method]The single factor analysis and orthogonal design experiment was used to determine the optimal fermentation conditions for natural fermented chopped pepper. [Result]The optimal fermentation conditions of chopped pepper were as follows： 5% salt， 5% sugar and 16 days fermentation at 28 ℃.Under the fermentation conditions， the nitrite content of chopped pepper was only 1.32 mg/kg， the sensory score was 84， and the quality was good.[Conclusion]This study can provide a theoretical basis for the standardization and industrial production of fermented chopped pepper.
Key words Chopped pepper;Nitrite;Sensory evaluation;Optimization of fermentation conditions
剁椒是以茄科辣椒属一年生或有限多年生草本植物辣椒（Capsicum annuum）为原料，经分拣、清洗、剁碎等前处理，加入适量大蒜、食盐及白砂糖等辅料，以天然附着菌种（乳酸菌为主菌群）进行自然发酵，腌制而成的特色风味食品[1-3]。天然发酵剁椒因原料中富含辣椒素、VC、VB、胡萝卜素、钙元素等营养物质，且经发酵后产生大量游离氨基酸、有机酸、可溶性多糖等活性物质而具有减肥、抗癌、抗炎症、抗突变，改善心脏功能、缓解皮肤疼痛等多种生理保健功能[3-4]。随着剁椒标准化工业生产技术的成熟及世界各地饮食文化及饮食习俗的渗透交融，剁椒凭借其独特的口感与风味及其潜在的巨大市场，逐渐成为餐桌上必不可少的调味品[5-6]。
天然發酵剁椒虽以乳酸菌等益生性微生物为主要发酵菌群，但传统自然发酵过程中发酵条件不稳定等因素导致剁椒存在产品品质不稳定，表面易“生花”，高盐，有一定卫生安全风险等问题[5]。加之发酵过程中致癌性物质黄曲霉毒素及亚硝酸盐产生的不可避免性，使天然发酵剁椒的推广与扩大生产受到进一步限制[5，7]。随着食品安全意识的提升，易产生致癌性物质黄曲霉毒素及亚硝酸盐的腌制类食品安全问题逐渐成为人们关注的焦点[6]。为提升传统发酵剁椒食用安全与风味，实现天然发酵剁椒标准化生产与工业化，笔者以天然发酵剁椒的感官评分及发酵过程中亚硝酸盐含量与pH变化等发酵参数为指标，对发酵剁椒的天然发酵工艺进行优化，旨在为发酵剁椒标准化与工业化生产提供理论参考与科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
原料：新鲜红辣椒购于广西贺州当地农贸市场;食盐和白砂糖购于当地超市。
主要药品及试剂：亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂、亚硝酸钠、活性炭粉、对氨基苯磺酸、冰乙酸、盐酸、盐酸萘乙二胺，该试验所用药品与试剂如无特别说明均为分析纯。
主要溶液：亚铁氰化钾溶液（106.0 g/L）：精确称取10.60 g 亚铁氰化钾，用适量蒸馏水溶解并定容至100 mL;乙酸锌溶液（220.0 g/L）：精确称取11.0 g乙酸锌，用1.5 mL冰乙酸溶解后蒸馏水定容至50 mL;饱和硼砂溶液（50.0 g/L）：精确称取5.0 g硼砂溶于80 mL热水，冷却至室温定容至100 mL，备用;浓度20%盐酸（v/m）：精确量取54 mL 37%盐酸溶液，适量稀释后蒸馏水定容至100 mL;对氨基苯磺酸溶液（4.0 g/L）：取0.4 g对氨基苯磺酸溶于100 mL 20%盐酸，振荡混匀后置于棕色瓶中避光保存;盐酸萘乙二胺溶液（2.0 g/L）：精确称取0.2 g盐酸萘乙二胺溶于蒸馏水，定容至100 mL后混匀，置于棕色瓶中避光保存;亚硝酸钠标准液母液（200 μg/mL）：准确称取0.100 0 g 亚硝酸钠，用适量蒸馏水溶解后定容至500 mL，混匀备用;亚硝酸钠标准液（5.0 μg/mL）：将亚硝酸钠标准溶液母液2.50 mL移至100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释并定容至刻度。 1.2 仪器
722S型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），AZ8601型pH计（台湾衡欣科技股份有限公司），DHP-9082电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），JJ1000 Y 电子天平（深圳市新朗普电子科技有限公司），HHS 恒温水浴锅（上海程造仪器设备有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 天然剁椒的发酵制作。
参照文献[5]的方法并结合贺州当地传统剁椒制作方法，发酵过程分前处理、发酵及后处理3个阶段，前处理除去机械损伤的辣椒，将剁碎后加辅料的辣椒置于已灭菌且干燥的瓶中密闭发酵。需提先加入适量食盐、白砂糖，搅拌均匀后密封发酵，于28 ℃恒温发酵15 d。后处理可根据不同地域饮食习惯搭配肉制品、蔬菜等。
1.3.2 剁椒中亚硝酸盐含量的检测。
1.3.2.1 亚硝酸盐检测标准曲线的绘制。
分别取5.0 μg/mL不同体积的亚硝酸钠标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于50 mL容量瓶中，依次加入2 mL对氨基苯磺酸溶液（4.0 g/L），混匀，静置5 min 后加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2.0 g/L），蒸馏水定容混匀。静置15 min后检测538 nm处吸光值，以亚硝酸钠浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[8-9]。
1.3.2.2 亚硝酸盐含量的检测。
（1）亚硝酸盐提取液的制备：准确称取5.0 g剁椒于研钵中，用吸水纸吸去多余汁水，研磨成泥状时加入12.5 mL饱和硼砂溶液（50 g/L），混匀后用150 mL蒸馏水（70 ℃）充分洗涤并将冲洗液收集至250 mL锥形瓶中，混匀，沸水浴15 min，冷却至室温即为剁椒样品的亚硝酸盐粗提液。
（2）亚硝酸盐粗提液的处理：将5 mL亚铁氰化钾溶液（106.0 g/L）加入亚硝酸盐粗提液中，混匀加5 mL乙酸锌溶液（220.0 g/L）以沉淀蛋白质，并用蒸馏水定容至250 mL[10]。在定容液中加入3.0 g活性炭粉[11]，充分混匀，静置30 min后用滤纸过滤即得亚硝酸钠样品检测液。
（3）样品中亚硝酸盐的检测：取40 mL样品检测液于50 mL容量瓶中，加入2 mL对氨基苯磺酸溶液（4.0 g/L）后混匀，静置5 min后加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2.0 g/L），蒸馏水定容，混匀后静置15 min[12]，检测样品液538 nm时的吸光值，每个样品重复3次[13-14]。样品中亚硝酸盐含量参照式（1）计算[14]，计算结果保留2位有效数字。
X=（m2×1 000）/（m1×V2/V1×1 000）（1）
式中，X为样品中亚硝酸盐含量，mg/kg;
m1为样品质量，g;
m2为测定样品液中亚硝酸盐质量，μg;
V1为样品亚硝酸盐处理液体积，mL;
V2为测定用样液体积，mL。
1.4 剁椒天然发酵条件的单因素试验
以28 ℃为发酵温度，分别研究食盐添加量、白砂糖添加量及发酵时间对剁椒发酵品质的影响。单因素水平设计见表1。
1.5 剁椒天然发酵条件的正交试验设计
在单因素分析的基础上，对发酵过程中食盐添加量、白砂糖添加量及发酵时间进行L9（34）正交试验，并结合亚硝酸盐含量、感官评分及pH等指标确定剁椒天然发酵的最优工艺。
1.6 评价指标
1.6.1 pH测定。
便携式pH计测定剁椒发酵样品pH。
1.6.2 感官评价。
感官评价采用100分评分制，邀请10名食品专业学生，从色泽、形态、风味、口感4个指标对剁椒样品进行感官评分和评价（表2）。
1.7 数据整理
采用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理和分析;采用SPSS 22.0软件对数据进行显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 亚硝酸盐标准曲线
亚硝酸盐含量检测的线性回归方程见图1。y=0.014 6 x +0.002 7，R2=0.999 5，可用于剁椒中亚硝酸盐含量的检测。
2.2 剁椒天然发酵工艺的优化
2.2.1 影响因素分析。
2.2.1.1 食盐添加量对剁椒发酵的影响。
白砂糖添加量4%（m/m），28 ℃发酵16 d，食盐添加量对剁椒发酵的影响结果见表3。由表3可知，食盐添加量对剁椒发酵品质有影响，当食盐添加量为1%时，亚硝酸盐含量高达4.27 mg/kg（高于国家食品卫生安全标准4.00 mg/kg），感官评价分值较低（73分），原因可能与低盐含量难以有效抑制杂菌生长[15]，导致硝酸盐还原类微生物及腐败菌等生长活跃，大量硝酸盐被还原为亚硝酸盐[16]，并严重影响剁椒品质。高盐（食盐添加量为9%）发酵时，亚硝酸盐含量较低（2.49 mg/kg），但感官评价分值极低（70分）。结合差异显著性分析结果可知，低盐（1%）发酵能促进亚硝酸盐产生，高盐（9%）能抑制亚硝酸盐合成，且二者差异显著（P<0.05）;较高浓度的食盐含量（3%、5%、7%）对亚硝酸盐含量及感官评价的影响均不显著（P>0.05），其中5%是剁椒发酵的最适宜食盐添加量，此时亚硝酸盐含量较低（2.83 mg/kg），感官评价最好（85分）。加之食盐添加量对剁椒样品pH未产生显著差异（P>0.05）的影响，综合考虑，确定将食盐添加量3%、5%和7%作为正交设计试验中食盐添加量的3个水平。
2.2.1.2 白砂糖添加量对剁椒发酵的影響。 食盐添加量为5%，28 ℃发酵16 d后，白砂糖添加量对剁椒发酵品质的影响结果见表4。由表4可知，白砂糖添加量对剁椒品质产生影响，但影响不显著（P>0.05）;对样品pH的影响更是微乎其微（P>0.05）。加入白砂糖后，亚硝酸盐含量与白砂糖添加量呈反比关系，即随着白砂糖添加量的增加，亚硝酸盐含量反而降低，这可能与添加白砂糖后剁椒中乳酸菌等发酵菌株迅速生长，亚硝酸盐被大量降解有关[17]。综合考虑，确定将白砂糖添加量3%、4%和5%作为正交试验中白砂糖添加量的3个水平。
2.2.1.3 发酵时间对剁椒发酵的影响。
食盐添加量5%、白砂糖添加量4%，28 ℃发酵条件下，发酵时间对剁椒发酵品质的影响结果见表5。由表5可知，发酵时间对剁椒品质及亚硝酸盐含量均会产生影响，但对剁椒样品pH影响不大。结合差异性分析可知，发酵时间过短（短于8 d）或过长（长于8 d）样品中亚硝酸盐含量的变化不显著且无明显差异（P>0.05）。发酵时间少于12 d剁椒品质较差（感官评分低于70分），超过16 d后剁椒品质也有所下降（71分），这可能与发酵时间过短剁椒未充分发酵及发酵时间过久导致其他杂菌大量增长有关[17]。结合发酵16 d与20 d时剁椒品质存在显著差异（P<0.05）的分析结果，认定发酵16 d后为最佳发酵时长。综合亚硝酸盐含量、pH变化及感官评价结果，确定将发酵时长为16、18、20 d作为正交试验中发酵时间的3个水平。
2.2.2 影响因素的正交试验结果。
在单因素试验结果的基础之上，采用L9（34）正交设计，以确定剁椒天然发酵的最佳工艺条件。正交试验因素水平设计和结果见表6、7。
分析表7结果可知，影响剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量各因子主次顺序为 A>C>B，表明食盐添加量对剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量的影响最大，白砂糖添加量则对剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量的影响最小。基于剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量变化的结果，剁椒天然发酵的最优工艺组合为A2B3C1。剁椒感官评分的结果则表明，影响剁椒发酵品质各因子的主次顺序是 A>B>C，表明食盐添加量对剁椒品质的影响最大，而发酵时间的作用最小。基于反映剁椒发酵品质的感官评分结果，剁椒天然发酵的最优工艺组合为A2B3C1。综合比较，发现剁椒发酵品质的变化与剁椒天然发酵过程中亚硝酸盐变化呈现一定的相关性，即亚硝酸盐含量低的天然发酵剁椒品质较好。因此，剁椒天然发酵的最优工艺条件为食盐添加量5%，白砂糖添加量5%，28 ℃发酵16 d。
3 结论
该研究采用自然发酵法，通过单因素分析和正交试验，得到剁椒天然发酵的最优发酵工艺参数，即食盐添加量为5%，白砂糖添加量为5%，28 ℃发酵16 d。该条件下，可得到盐含量低、品质佳（感官评分84分）、亚硝酸盐含量低 （仅为1.32 mg/kg，远低于国家食品卫生安全标准4.00 mg/kg）的天然发酵剁椒产品，进而为低盐、低亚硝酸盐含量剁椒纯种发酵或混合发酵的标准化、工业化生产与制作提供理论参考。
参考文献
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关键词 剁椒;亚硝酸盐;感官评价;发酵工艺优化
中图分类号 TS255.5文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）10-0153-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.041
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Optimization of Fermentation Conditions for Natural Fermented Chopped Pepper
HUANG Wu-yu1， GONG Fu-ming2， HE Cai-mei1
（1. School of Food and Bioengineering， Hezhou University， Hezhou， Guangxi 542899;2. School of Basic Medical Sciences，Dehong Vocational College， Mangshi， Yunnan 678400）
Abstract [Objective]To screen the best fermentation technology of chopped pepper. [Method]The single factor analysis and orthogonal design experiment was used to determine the optimal fermentation conditions for natural fermented chopped pepper. [Result]The optimal fermentation conditions of chopped pepper were as follows： 5% salt， 5% sugar and 16 days fermentation at 28 ℃.Under the fermentation conditions， the nitrite content of chopped pepper was only 1.32 mg/kg， the sensory score was 84， and the quality was good.[Conclusion]This study can provide a theoretical basis for the standardization and industrial production of fermented chopped pepper.
Key words Chopped pepper;Nitrite;Sensory evaluation;Optimization of fermentation conditions
剁椒是以茄科辣椒属一年生或有限多年生草本植物辣椒（Capsicum annuum）为原料，经分拣、清洗、剁碎等前处理，加入适量大蒜、食盐及白砂糖等辅料，以天然附着菌种（乳酸菌为主菌群）进行自然发酵，腌制而成的特色风味食品[1-3]。天然发酵剁椒因原料中富含辣椒素、VC、VB、胡萝卜素、钙元素等营养物质，且经发酵后产生大量游离氨基酸、有机酸、可溶性多糖等活性物质而具有减肥、抗癌、抗炎症、抗突变，改善心脏功能、缓解皮肤疼痛等多种生理保健功能[3-4]。随着剁椒标准化工业生产技术的成熟及世界各地饮食文化及饮食习俗的渗透交融，剁椒凭借其独特的口感与风味及其潜在的巨大市场，逐渐成为餐桌上必不可少的调味品[5-6]。
天然發酵剁椒虽以乳酸菌等益生性微生物为主要发酵菌群，但传统自然发酵过程中发酵条件不稳定等因素导致剁椒存在产品品质不稳定，表面易“生花”，高盐，有一定卫生安全风险等问题[5]。加之发酵过程中致癌性物质黄曲霉毒素及亚硝酸盐产生的不可避免性，使天然发酵剁椒的推广与扩大生产受到进一步限制[5，7]。随着食品安全意识的提升，易产生致癌性物质黄曲霉毒素及亚硝酸盐的腌制类食品安全问题逐渐成为人们关注的焦点[6]。为提升传统发酵剁椒食用安全与风味，实现天然发酵剁椒标准化生产与工业化，笔者以天然发酵剁椒的感官评分及发酵过程中亚硝酸盐含量与pH变化等发酵参数为指标，对发酵剁椒的天然发酵工艺进行优化，旨在为发酵剁椒标准化与工业化生产提供理论参考与科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
原料：新鲜红辣椒购于广西贺州当地农贸市场;食盐和白砂糖购于当地超市。
主要药品及试剂：亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂、亚硝酸钠、活性炭粉、对氨基苯磺酸、冰乙酸、盐酸、盐酸萘乙二胺，该试验所用药品与试剂如无特别说明均为分析纯。
主要溶液：亚铁氰化钾溶液（106.0 g/L）：精确称取10.60 g 亚铁氰化钾，用适量蒸馏水溶解并定容至100 mL;乙酸锌溶液（220.0 g/L）：精确称取11.0 g乙酸锌，用1.5 mL冰乙酸溶解后蒸馏水定容至50 mL;饱和硼砂溶液（50.0 g/L）：精确称取5.0 g硼砂溶于80 mL热水，冷却至室温定容至100 mL，备用;浓度20%盐酸（v/m）：精确量取54 mL 37%盐酸溶液，适量稀释后蒸馏水定容至100 mL;对氨基苯磺酸溶液（4.0 g/L）：取0.4 g对氨基苯磺酸溶于100 mL 20%盐酸，振荡混匀后置于棕色瓶中避光保存;盐酸萘乙二胺溶液（2.0 g/L）：精确称取0.2 g盐酸萘乙二胺溶于蒸馏水，定容至100 mL后混匀，置于棕色瓶中避光保存;亚硝酸钠标准液母液（200 μg/mL）：准确称取0.100 0 g 亚硝酸钠，用适量蒸馏水溶解后定容至500 mL，混匀备用;亚硝酸钠标准液（5.0 μg/mL）：将亚硝酸钠标准溶液母液2.50 mL移至100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释并定容至刻度。 1.2 仪器
722S型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），AZ8601型pH计（台湾衡欣科技股份有限公司），DHP-9082电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），JJ1000 Y 电子天平（深圳市新朗普电子科技有限公司），HHS 恒温水浴锅（上海程造仪器设备有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 天然剁椒的发酵制作。
参照文献[5]的方法并结合贺州当地传统剁椒制作方法，发酵过程分前处理、发酵及后处理3个阶段，前处理除去机械损伤的辣椒，将剁碎后加辅料的辣椒置于已灭菌且干燥的瓶中密闭发酵。需提先加入适量食盐、白砂糖，搅拌均匀后密封发酵，于28 ℃恒温发酵15 d。后处理可根据不同地域饮食习惯搭配肉制品、蔬菜等。
1.3.2 剁椒中亚硝酸盐含量的检测。
1.3.2.1 亚硝酸盐检测标准曲线的绘制。
分别取5.0 μg/mL不同体积的亚硝酸钠标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于50 mL容量瓶中，依次加入2 mL对氨基苯磺酸溶液（4.0 g/L），混匀，静置5 min 后加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2.0 g/L），蒸馏水定容混匀。静置15 min后检测538 nm处吸光值，以亚硝酸钠浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[8-9]。
1.3.2.2 亚硝酸盐含量的检测。
（1）亚硝酸盐提取液的制备：准确称取5.0 g剁椒于研钵中，用吸水纸吸去多余汁水，研磨成泥状时加入12.5 mL饱和硼砂溶液（50 g/L），混匀后用150 mL蒸馏水（70 ℃）充分洗涤并将冲洗液收集至250 mL锥形瓶中，混匀，沸水浴15 min，冷却至室温即为剁椒样品的亚硝酸盐粗提液。
（2）亚硝酸盐粗提液的处理：将5 mL亚铁氰化钾溶液（106.0 g/L）加入亚硝酸盐粗提液中，混匀加5 mL乙酸锌溶液（220.0 g/L）以沉淀蛋白质，并用蒸馏水定容至250 mL[10]。在定容液中加入3.0 g活性炭粉[11]，充分混匀，静置30 min后用滤纸过滤即得亚硝酸钠样品检测液。
（3）样品中亚硝酸盐的检测：取40 mL样品检测液于50 mL容量瓶中，加入2 mL对氨基苯磺酸溶液（4.0 g/L）后混匀，静置5 min后加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2.0 g/L），蒸馏水定容，混匀后静置15 min[12]，检测样品液538 nm时的吸光值，每个样品重复3次[13-14]。样品中亚硝酸盐含量参照式（1）计算[14]，计算结果保留2位有效数字。
X=（m2×1 000）/（m1×V2/V1×1 000）（1）
式中，X为样品中亚硝酸盐含量，mg/kg;
m1为样品质量，g;
m2为测定样品液中亚硝酸盐质量，μg;
V1为样品亚硝酸盐处理液体积，mL;
V2为测定用样液体积，mL。
1.4 剁椒天然发酵条件的单因素试验
以28 ℃为发酵温度，分别研究食盐添加量、白砂糖添加量及发酵时间对剁椒发酵品质的影响。单因素水平设计见表1。
1.5 剁椒天然发酵条件的正交试验设计
在单因素分析的基础上，对发酵过程中食盐添加量、白砂糖添加量及发酵时间进行L9（34）正交试验，并结合亚硝酸盐含量、感官评分及pH等指标确定剁椒天然发酵的最优工艺。
1.6 评价指标
1.6.1 pH测定。
便携式pH计测定剁椒发酵样品pH。
1.6.2 感官评价。
感官评价采用100分评分制，邀请10名食品专业学生，从色泽、形态、风味、口感4个指标对剁椒样品进行感官评分和评价（表2）。
1.7 数据整理
采用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理和分析;采用SPSS 22.0软件对数据进行显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 亚硝酸盐标准曲线
亚硝酸盐含量检测的线性回归方程见图1。y=0.014 6 x +0.002 7，R2=0.999 5，可用于剁椒中亚硝酸盐含量的检测。
2.2 剁椒天然发酵工艺的优化
2.2.1 影响因素分析。
2.2.1.1 食盐添加量对剁椒发酵的影响。
白砂糖添加量4%（m/m），28 ℃发酵16 d，食盐添加量对剁椒发酵的影响结果见表3。由表3可知，食盐添加量对剁椒发酵品质有影响，当食盐添加量为1%时，亚硝酸盐含量高达4.27 mg/kg（高于国家食品卫生安全标准4.00 mg/kg），感官评价分值较低（73分），原因可能与低盐含量难以有效抑制杂菌生长[15]，导致硝酸盐还原类微生物及腐败菌等生长活跃，大量硝酸盐被还原为亚硝酸盐[16]，并严重影响剁椒品质。高盐（食盐添加量为9%）发酵时，亚硝酸盐含量较低（2.49 mg/kg），但感官评价分值极低（70分）。结合差异显著性分析结果可知，低盐（1%）发酵能促进亚硝酸盐产生，高盐（9%）能抑制亚硝酸盐合成，且二者差异显著（P<0.05）;较高浓度的食盐含量（3%、5%、7%）对亚硝酸盐含量及感官评价的影响均不显著（P>0.05），其中5%是剁椒发酵的最适宜食盐添加量，此时亚硝酸盐含量较低（2.83 mg/kg），感官评价最好（85分）。加之食盐添加量对剁椒样品pH未产生显著差异（P>0.05）的影响，综合考虑，确定将食盐添加量3%、5%和7%作为正交设计试验中食盐添加量的3个水平。
2.2.1.2 白砂糖添加量对剁椒发酵的影響。 食盐添加量为5%，28 ℃发酵16 d后，白砂糖添加量对剁椒发酵品质的影响结果见表4。由表4可知，白砂糖添加量对剁椒品质产生影响，但影响不显著（P>0.05）;对样品pH的影响更是微乎其微（P>0.05）。加入白砂糖后，亚硝酸盐含量与白砂糖添加量呈反比关系，即随着白砂糖添加量的增加，亚硝酸盐含量反而降低，这可能与添加白砂糖后剁椒中乳酸菌等发酵菌株迅速生长，亚硝酸盐被大量降解有关[17]。综合考虑，确定将白砂糖添加量3%、4%和5%作为正交试验中白砂糖添加量的3个水平。
2.2.1.3 发酵时间对剁椒发酵的影响。
食盐添加量5%、白砂糖添加量4%，28 ℃发酵条件下，发酵时间对剁椒发酵品质的影响结果见表5。由表5可知，发酵时间对剁椒品质及亚硝酸盐含量均会产生影响，但对剁椒样品pH影响不大。结合差异性分析可知，发酵时间过短（短于8 d）或过长（长于8 d）样品中亚硝酸盐含量的变化不显著且无明显差异（P>0.05）。发酵时间少于12 d剁椒品质较差（感官评分低于70分），超过16 d后剁椒品质也有所下降（71分），这可能与发酵时间过短剁椒未充分发酵及发酵时间过久导致其他杂菌大量增长有关[17]。结合发酵16 d与20 d时剁椒品质存在显著差异（P<0.05）的分析结果，认定发酵16 d后为最佳发酵时长。综合亚硝酸盐含量、pH变化及感官评价结果，确定将发酵时长为16、18、20 d作为正交试验中发酵时间的3个水平。
2.2.2 影响因素的正交试验结果。
在单因素试验结果的基础之上，采用L9（34）正交设计，以确定剁椒天然发酵的最佳工艺条件。正交试验因素水平设计和结果见表6、7。
分析表7结果可知，影响剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量各因子主次顺序为 A>C>B，表明食盐添加量对剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量的影响最大，白砂糖添加量则对剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量的影响最小。基于剁椒发酵过程中亚硝酸盐含量变化的结果，剁椒天然发酵的最优工艺组合为A2B3C1。剁椒感官评分的结果则表明，影响剁椒发酵品质各因子的主次顺序是 A>B>C，表明食盐添加量对剁椒品质的影响最大，而发酵时间的作用最小。基于反映剁椒发酵品质的感官评分结果，剁椒天然发酵的最优工艺组合为A2B3C1。综合比较，发现剁椒发酵品质的变化与剁椒天然发酵过程中亚硝酸盐变化呈现一定的相关性，即亚硝酸盐含量低的天然发酵剁椒品质较好。因此，剁椒天然发酵的最优工艺条件为食盐添加量5%，白砂糖添加量5%，28 ℃发酵16 d。
3 结论
该研究采用自然发酵法，通过单因素分析和正交试验，得到剁椒天然发酵的最优发酵工艺参数，即食盐添加量为5%，白砂糖添加量为5%，28 ℃发酵16 d。该条件下，可得到盐含量低、品质佳（感官评分84分）、亚硝酸盐含量低 （仅为1.32 mg/kg，远低于国家食品卫生安全标准4.00 mg/kg）的天然发酵剁椒产品，进而为低盐、低亚硝酸盐含量剁椒纯种发酵或混合发酵的标准化、工业化生产与制作提供理论参考。
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