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摘要 [目的]研究构树叶提取物的抗病毒活性。[方法]采用MTT法，观察构树叶的水、75%乙醇和50%丙酮提取物及不同给药方式对NDV、IBDV、ILTV和IBV等病毒感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）活性的影响，探讨构树叶提取物体外抗病毒活性及其作用机制。[结果]乙醇和丙酮提取物能显著提高NDV感染的CEF细胞活性，丙酮提取物能显著提高ILTV和IBV感染的CEF细胞活性，但对IBDV诱导的CEF细胞病变无影响。经丙酮提取物预处理的CEF细胞对NDV或ILTV感染的抵抗力呈上升趋势。[结论]构树提取物中的有效成分可能通过阻断病毒对宿主细胞的识别和粘附发挥其抗病毒活性。
关键词 构树叶；提取物；抗病毒活性
中图分类号 S853.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）29-0144-03
构树（Broussonetia papyrifera（L.）Vent）是桑科、构树属的一种落叶乔木，其根、茎、叶和果实均可入药，具有消肿利尿、清热利湿、补肾明目等功效[1]。研究证实，构树含有多种生物活性物质，具有抗细菌[2]、抗真菌[3]、抗氧化[4-5]、抗炎[6]和抗肿瘤[7-8]活性。笔者在前期研究中发现饲喂构树叶的畜禽对病毒感染表现出较强的抵抗力，其发病率和死亡率均有不同程度的下降[8]。为了进一步验证构树叶的抗病毒活性成分，笔者观察了构树叶提取物对NDV、IBDV、IBV和ILTV等常见动物病毒增殖的抑制作用，为筛选抗病毒中草药提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。构树叶，采自广东海洋大学优质牧草试验基地，由刘海博士鉴定，50 ℃干燥，粉碎过60目筛。
SPF鸡胚，购自北京梅里亚公司，37.8 ℃孵化至10日龄备用。
1.1.2 试剂。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培养基（美国Gibco公司），MTT（美国Sigma公司），台盼蓝、乙醇、丙酮均为分析纯试剂。
1.1.3 病毒。新城疫病毒（NDV，Roakin株）、传染性法氏囊病毒（IBDV，BC6-85株）、传染性喉气管炎病毒（ILTV，SA-2株）、传染性支气管炎病毒（IBV，ZJ-K1株），均由广东海洋大学农学院刘铀教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1
构树叶提取物的制备。将构树叶阴干粉碎，分别用蒸馏水、75%乙醇和50%丙酮浸泡3 h，纱布过滤，滤液经55 ℃减压浓缩后冷冻干燥。
1.2.2
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备。取9～10日龄SPF鸡胚用0.2%新洁尔灭、75%酒精依次消毒蛋壳，无菌采集胚体，去除头、爪和内脏，用眼科剪将胚体剪切成1～2 mm3大小的组织块，PBS（pH 7.2）漂洗2～3次，加入0.25%胰酶于37 ℃水浴消化10 min，加入少量DMEM细胞维持液终止消化，上清液过60目筛，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，用DMEM生长液将细胞稀释至2×105个/mL[9]。
1.2.3
MTT法测定构树叶提取物对CEF的毒性作用。将构树提取物用DMEM细胞生长液2倍倍比稀释，加入96孔细胞培养板，每孔50 μL，每个稀释度设4个重复，分别加入等体积CEF细胞悬液，使细胞终浓度为1×105个/mL，另设4孔正常细胞对照。置37 ℃、5% CO2培养箱中，观察细胞增殖与贴壁情况，3 d后取出培养板，每孔加入0.5% MTT 20 μL，继续培养4 h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算CEF细胞存活率，比较构树叶提取物的毒性作用[10]。细胞存活率=（处理组OD490/对照组OD490）×100%。
1.2.4
构树叶提取物体外抗病毒活性。将CEF细胞以1×105个/mL接种至96孔板，待细胞长成单层，弃去培养液。根据“1.2.3”测定结果，用细胞维持液稀释构树叶提取物至浓度为2.5 mg/mL，每孔50 μL，随后加入100TCID50的病毒悬液50 μL，每种供试病毒做4个重复。另设细胞对照组（加100 μL的DMEM维持液）和病毒对照组（加入100TCID50的病毒悬液）。将细胞培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱，观察病毒引起的细胞病变（CPE）。当病毒对照组出现75%以上CPE时，每孔加0.5% MTT 20 μL，继续培养4 h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪测定吸光度OD490。
1.2.5
不同处理方式对构树叶提取物抗病毒活性的影响。用细胞维持液稀释构树叶乙醇或丙酮提取物至终浓度为2.5 mg/mL。根据“1.2.4”的结果，以NDV、ILTV和IBV为供试病毒，分别进行下列处理，检测不同给药方式对构树叶提取物的抗病毒活性。
处理①构树叶提取物50 μL加至CEF细胞单层作用1 h后，再加入含100TCID50供试病毒悬液50 μL。
处理②构树叶提取物50 μL与含100TCID50供试病毒悬液50 μL，混匀，37 ℃培养1 h后，加入CEF细胞单层培养孔。
处理③构树叶提取物50 μL、含100TCID50供试病毒悬液50 μL，混匀，同时加入CEF细胞单层。
1.3 数据处理
试验结果用平均值±标准差（±S）表示，数据用SPSS 19.0处理，用方差分析比较组间差异。
2 结果与分析
2.1 构树叶提取物的制备
500 g构树叶经水提取获得70 g稠膏，提取率为14.0%；600 g构树叶经75%乙醇提取获得93 g稠膏，提取率为15.5%；600 g构树叶经50%丙酮提取获得160 g稠膏，提取率为16.0%。 2.2 构树叶提取物对CEF的毒性作用
由表1可见，当培养液中3种构树提取物终浓度高于10.00 mg/mL时，对CEF细胞均有一定的毒性作用，表现为CEF细胞增殖速度降低，少数细胞变圆、上浮；当终浓度低于2.50 mg/mL时，构树叶乙醇或丙酮提取物处理的CEF细胞存活率与对照组基本相同，且0.62～1.25 mg/mL乙醇提取物、0.31～2.50 mg/mL丙酮提取物对CEF细胞增殖还有一定促进作用，但0.31 mg/mL水提取物处理的CEF细胞存活率仍低于对照组。
2.3 构树叶提取物体外抗病毒活性
根据“2.2”试验结果，选择终浓度为1.25 mg/mL的构树叶提取物，观察其对病毒诱导的细胞病变的抑制作用。由表2可见，培养液添加构树叶提取物的CEF细胞的OD490显著高于对照组，细胞变圆、融合现象减少，细胞病变时间延迟，表明乙醇和丙酮提取物对NDV感染引起的CPE均有不同程度的抑制作用（P<0.05）；构树叶丙酮提取物能显著提高ILTV感染的CEF细胞活性（P<0.05），乙醇和水提取物无此活性；构树叶提取物对IBDV感染引起的CEF细胞活性无影响（P>0.05）；在IBV感染的CEF细胞中，仅构树叶丙酮提取物具有一定的抗病毒活性（P<0.05）。
2.4 不同处理方式对构树叶提取物抗病毒活性的影响
与对照组相比，构树叶乙醇或丙酮提取物不同给药方式对NDV引起的细胞病变有显著的抑制作用（P<0.05）；
构树叶丙酮提取物对ILTV引起的的细胞病变亦有显著的抑制作用（P<0.05），用乙醇提取物预处理能显著提高ILTV感染的CEF细胞活性（P<0.05），但乙醇提取物处理对ILTV感染性及其引起的细胞病变无明显影响（P>0.05）；
采用构树提取物预处理的CEF细胞活性有升高的趋势，但各处理组间差异不显著（P>0.05）。对IBV而言，仅丙酮提取物有显著的抗病毒活性（P<0.05），各处理组间无显著差异（P>0.05）。
3 小结与讨论
正常原代培养的CEF细胞呈梭状，有良好的贴壁性。当培养液中构树叶提取物终浓度达10.00 mg/mL时，CEF细胞活性下降，细胞变圆、脱落，随着培养时间延长至72 h，CEF细胞存活率仅为40%左右，说明构树叶提取物中的某些化学成分对CEF细胞具有一定毒性。当构树叶提取物终浓度低于2.50 mg/mL时，添加构树叶提取物的各组CEF细胞存活率与对照组细胞大致相同。培养液中构树叶乙醇提取物终浓度为0.62～1.25 mg/mL、丙酮提取物终浓度为0.31～2.50 mg/mL时，对CEF细胞增殖具有一定促进作用，部分抵消了构树叶提取物对CEF细胞的毒性作用。因此，该试验中选择终浓度为1.25 mg/mL的构树叶提取物，观察其抗病毒活性。
NDV、ILTV、IBDV和IBV分属于副粘病毒科、疱疹病毒科、双链RNA病毒科和冠状病毒科，除IBDV外，病毒表面均有脂质结构的囊膜，对表面活性剂或有机溶剂较敏感。该试验结果显示，构树叶丙酮提取物均能不同程度地提高NDV感染的CEF细胞活性，延缓CPE出现；乙醇提取物仅对NDV感染的宿主细胞有一定的保护作用；而水提取物对上述病毒感染均无明显抑制作用。可见，构树叶抗病毒活性可能与其中的脂溶性化合物有关，这些化合物一方面通过阻断病毒对宿主细胞膜受体的识别和粘附；另一方面则通过与NDV、ILTV或IBV囊膜中的脂质结合，进一步阻断病毒对宿主细胞膜受体的识别，延缓病毒侵入和CPE出现，从而发挥其抗病毒活性。构树叶提取物对IBDV感染无抑制作用可能与该病毒表面缺乏囊膜结构有关。
参考文献
[1] 秦路平，杨庆柱，辛海量.构树的本草考证及其药用价值[J].药学实践杂志，1999，17（4）：254-255.
[2] 刘晓军，刘铀，陈绍红，等.构树叶提取物抑菌活性的初步观察[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（19）：283-286.
[3] SOHN H Y，KWON C S，SON K H. Fungicidal effect of prenylated flavonol，papyriflavonol A，isolated from Broussonetia papyrifrea（L.）vent.against Candida albicans[J].Journal of microbiology and biotechnology，2010，20（10）：1397-1402.
[4] ZHOU X J，MEI E Q，ZHANG L，et al.Antioxidant phenolics from Broussonetia papyrifera fruits[J].Journal of Asian natural products research，2010，12（5）：399-406.
[5] TSAI F H，LIEN J C，LIN L W，et al.Protective effect of Broussonetia papyrifera against hydrogen peroxide-induced oxidative stress SH-SY5Y cells[J].Bioscience，biotechnology and biochemistry，2009，73（9）：1933-1939.
[6] WANG L，SON H J，XU M L，et al.Anti inflammatory and anticancer properties of dichoromethane and butanol fractions from the stem bark of Broussonetia papyrifrea[J].Journal of Korean society for applied biological chemistry，2010，53（3）：297-303.
[7] 朱开梅，李美波，骆彩珍.等.构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞增殖及其细胞周期的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（3）：153-156.
[8] 陈绍红，陈训耿，何景淋，等.构树黄酮诱导肝癌细胞凋亡的初步观察[J].安徽农业科学，2015，43（29）：32-34.
[9] 关伟军.家养动物细胞体外培养原理与技术[M].北京：科学出版社，2008：248-251.
[10] 刘钊，杨占秋，肖红，等.MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J].武汉大学学报（医学版），2004，25（3）：332-334.
关键词 构树叶；提取物；抗病毒活性
中图分类号 S853.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）29-0144-03
构树（Broussonetia papyrifera（L.）Vent）是桑科、构树属的一种落叶乔木，其根、茎、叶和果实均可入药，具有消肿利尿、清热利湿、补肾明目等功效[1]。研究证实，构树含有多种生物活性物质，具有抗细菌[2]、抗真菌[3]、抗氧化[4-5]、抗炎[6]和抗肿瘤[7-8]活性。笔者在前期研究中发现饲喂构树叶的畜禽对病毒感染表现出较强的抵抗力，其发病率和死亡率均有不同程度的下降[8]。为了进一步验证构树叶的抗病毒活性成分，笔者观察了构树叶提取物对NDV、IBDV、IBV和ILTV等常见动物病毒增殖的抑制作用，为筛选抗病毒中草药提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。构树叶，采自广东海洋大学优质牧草试验基地，由刘海博士鉴定，50 ℃干燥，粉碎过60目筛。
SPF鸡胚，购自北京梅里亚公司，37.8 ℃孵化至10日龄备用。
1.1.2 试剂。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培养基（美国Gibco公司），MTT（美国Sigma公司），台盼蓝、乙醇、丙酮均为分析纯试剂。
1.1.3 病毒。新城疫病毒（NDV，Roakin株）、传染性法氏囊病毒（IBDV，BC6-85株）、传染性喉气管炎病毒（ILTV，SA-2株）、传染性支气管炎病毒（IBV，ZJ-K1株），均由广东海洋大学农学院刘铀教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1
构树叶提取物的制备。将构树叶阴干粉碎，分别用蒸馏水、75%乙醇和50%丙酮浸泡3 h，纱布过滤，滤液经55 ℃减压浓缩后冷冻干燥。
1.2.2
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备。取9～10日龄SPF鸡胚用0.2%新洁尔灭、75%酒精依次消毒蛋壳，无菌采集胚体，去除头、爪和内脏，用眼科剪将胚体剪切成1～2 mm3大小的组织块，PBS（pH 7.2）漂洗2～3次，加入0.25%胰酶于37 ℃水浴消化10 min，加入少量DMEM细胞维持液终止消化，上清液过60目筛，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，用DMEM生长液将细胞稀释至2×105个/mL[9]。
1.2.3
MTT法测定构树叶提取物对CEF的毒性作用。将构树提取物用DMEM细胞生长液2倍倍比稀释，加入96孔细胞培养板，每孔50 μL，每个稀释度设4个重复，分别加入等体积CEF细胞悬液，使细胞终浓度为1×105个/mL，另设4孔正常细胞对照。置37 ℃、5% CO2培养箱中，观察细胞增殖与贴壁情况，3 d后取出培养板，每孔加入0.5% MTT 20 μL，继续培养4 h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算CEF细胞存活率，比较构树叶提取物的毒性作用[10]。细胞存活率=（处理组OD490/对照组OD490）×100%。
1.2.4
构树叶提取物体外抗病毒活性。将CEF细胞以1×105个/mL接种至96孔板，待细胞长成单层，弃去培养液。根据“1.2.3”测定结果，用细胞维持液稀释构树叶提取物至浓度为2.5 mg/mL，每孔50 μL，随后加入100TCID50的病毒悬液50 μL，每种供试病毒做4个重复。另设细胞对照组（加100 μL的DMEM维持液）和病毒对照组（加入100TCID50的病毒悬液）。将细胞培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱，观察病毒引起的细胞病变（CPE）。当病毒对照组出现75%以上CPE时，每孔加0.5% MTT 20 μL，继续培养4 h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪测定吸光度OD490。
1.2.5
不同处理方式对构树叶提取物抗病毒活性的影响。用细胞维持液稀释构树叶乙醇或丙酮提取物至终浓度为2.5 mg/mL。根据“1.2.4”的结果，以NDV、ILTV和IBV为供试病毒，分别进行下列处理，检测不同给药方式对构树叶提取物的抗病毒活性。
处理①构树叶提取物50 μL加至CEF细胞单层作用1 h后，再加入含100TCID50供试病毒悬液50 μL。
处理②构树叶提取物50 μL与含100TCID50供试病毒悬液50 μL，混匀，37 ℃培养1 h后，加入CEF细胞单层培养孔。
处理③构树叶提取物50 μL、含100TCID50供试病毒悬液50 μL，混匀，同时加入CEF细胞单层。
1.3 数据处理
试验结果用平均值±标准差（±S）表示，数据用SPSS 19.0处理，用方差分析比较组间差异。
2 结果与分析
2.1 构树叶提取物的制备
500 g构树叶经水提取获得70 g稠膏，提取率为14.0%；600 g构树叶经75%乙醇提取获得93 g稠膏，提取率为15.5%；600 g构树叶经50%丙酮提取获得160 g稠膏，提取率为16.0%。 2.2 构树叶提取物对CEF的毒性作用
由表1可见，当培养液中3种构树提取物终浓度高于10.00 mg/mL时，对CEF细胞均有一定的毒性作用，表现为CEF细胞增殖速度降低，少数细胞变圆、上浮；当终浓度低于2.50 mg/mL时，构树叶乙醇或丙酮提取物处理的CEF细胞存活率与对照组基本相同，且0.62～1.25 mg/mL乙醇提取物、0.31～2.50 mg/mL丙酮提取物对CEF细胞增殖还有一定促进作用，但0.31 mg/mL水提取物处理的CEF细胞存活率仍低于对照组。
2.3 构树叶提取物体外抗病毒活性
根据“2.2”试验结果，选择终浓度为1.25 mg/mL的构树叶提取物，观察其对病毒诱导的细胞病变的抑制作用。由表2可见，培养液添加构树叶提取物的CEF细胞的OD490显著高于对照组，细胞变圆、融合现象减少，细胞病变时间延迟，表明乙醇和丙酮提取物对NDV感染引起的CPE均有不同程度的抑制作用（P<0.05）；构树叶丙酮提取物能显著提高ILTV感染的CEF细胞活性（P<0.05），乙醇和水提取物无此活性；构树叶提取物对IBDV感染引起的CEF细胞活性无影响（P>0.05）；在IBV感染的CEF细胞中，仅构树叶丙酮提取物具有一定的抗病毒活性（P<0.05）。
2.4 不同处理方式对构树叶提取物抗病毒活性的影响
与对照组相比，构树叶乙醇或丙酮提取物不同给药方式对NDV引起的细胞病变有显著的抑制作用（P<0.05）；
构树叶丙酮提取物对ILTV引起的的细胞病变亦有显著的抑制作用（P<0.05），用乙醇提取物预处理能显著提高ILTV感染的CEF细胞活性（P<0.05），但乙醇提取物处理对ILTV感染性及其引起的细胞病变无明显影响（P>0.05）；
采用构树提取物预处理的CEF细胞活性有升高的趋势，但各处理组间差异不显著（P>0.05）。对IBV而言，仅丙酮提取物有显著的抗病毒活性（P<0.05），各处理组间无显著差异（P>0.05）。
3 小结与讨论
正常原代培养的CEF细胞呈梭状，有良好的贴壁性。当培养液中构树叶提取物终浓度达10.00 mg/mL时，CEF细胞活性下降，细胞变圆、脱落，随着培养时间延长至72 h，CEF细胞存活率仅为40%左右，说明构树叶提取物中的某些化学成分对CEF细胞具有一定毒性。当构树叶提取物终浓度低于2.50 mg/mL时，添加构树叶提取物的各组CEF细胞存活率与对照组细胞大致相同。培养液中构树叶乙醇提取物终浓度为0.62～1.25 mg/mL、丙酮提取物终浓度为0.31～2.50 mg/mL时，对CEF细胞增殖具有一定促进作用，部分抵消了构树叶提取物对CEF细胞的毒性作用。因此，该试验中选择终浓度为1.25 mg/mL的构树叶提取物，观察其抗病毒活性。
NDV、ILTV、IBDV和IBV分属于副粘病毒科、疱疹病毒科、双链RNA病毒科和冠状病毒科，除IBDV外，病毒表面均有脂质结构的囊膜，对表面活性剂或有机溶剂较敏感。该试验结果显示，构树叶丙酮提取物均能不同程度地提高NDV感染的CEF细胞活性，延缓CPE出现；乙醇提取物仅对NDV感染的宿主细胞有一定的保护作用；而水提取物对上述病毒感染均无明显抑制作用。可见，构树叶抗病毒活性可能与其中的脂溶性化合物有关，这些化合物一方面通过阻断病毒对宿主细胞膜受体的识别和粘附；另一方面则通过与NDV、ILTV或IBV囊膜中的脂质结合，进一步阻断病毒对宿主细胞膜受体的识别，延缓病毒侵入和CPE出现，从而发挥其抗病毒活性。构树叶提取物对IBDV感染无抑制作用可能与该病毒表面缺乏囊膜结构有关。
参考文献
[1] 秦路平，杨庆柱，辛海量.构树的本草考证及其药用价值[J].药学实践杂志，1999，17（4）：254-255.
[2] 刘晓军，刘铀，陈绍红，等.构树叶提取物抑菌活性的初步观察[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（19）：283-286.
[3] SOHN H Y，KWON C S，SON K H. Fungicidal effect of prenylated flavonol，papyriflavonol A，isolated from Broussonetia papyrifrea（L.）vent.against Candida albicans[J].Journal of microbiology and biotechnology，2010，20（10）：1397-1402.
[4] ZHOU X J，MEI E Q，ZHANG L，et al.Antioxidant phenolics from Broussonetia papyrifera fruits[J].Journal of Asian natural products research，2010，12（5）：399-406.
[5] TSAI F H，LIEN J C，LIN L W，et al.Protective effect of Broussonetia papyrifera against hydrogen peroxide-induced oxidative stress SH-SY5Y cells[J].Bioscience，biotechnology and biochemistry，2009，73（9）：1933-1939.
[6] WANG L，SON H J，XU M L，et al.Anti inflammatory and anticancer properties of dichoromethane and butanol fractions from the stem bark of Broussonetia papyrifrea[J].Journal of Korean society for applied biological chemistry，2010，53（3）：297-303.
[7] 朱开梅，李美波，骆彩珍.等.构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞增殖及其细胞周期的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（3）：153-156.
[8] 陈绍红，陈训耿，何景淋，等.构树黄酮诱导肝癌细胞凋亡的初步观察[J].安徽农业科学，2015，43（29）：32-34.
[9] 关伟军.家养动物细胞体外培养原理与技术[M].北京：科学出版社，2008：248-251.
[10] 刘钊，杨占秋，肖红，等.MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J].武汉大学学报（医学版），2004，25（3）：332-334.