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摘要 从自然死亡的玉米螟幼虫体内分离获得一株对玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌，编号为HB-3。该菌株产生菱形和方形两种晶体蛋白。纯化晶体及孢晶混合物的毒力测定结果表明，该菌株对玉米螟具有较高毒力，LC5。分别为5．82μg／mL和5．94μg／mL，对尖音库蚊也有一定毒力，LC50分别为16．59μg／mL和17．50／μg／mL。生理生化特性研究结果表明，HB-3与已知的蜡螟亚种(Bacillusthuringiensis subsp．galleriae)基本一致，血清型为H5ab。晶体蛋白的SDS-PAGE分析表明，HB-3菌株晶体蛋白至少由分子量为133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa的4种多肽组成。
关键词 苏云金芽孢杆菌； 晶体蛋白； 毒力测定； 生物学
中图分类号 S 476．11
苏云金芽孢杆菌(acillusthuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性反应细菌，杆状，能形成内生芽孢。该菌在自然界普遍存在，资源丰富，不同地理生态环境中其群体的分布特点、基因类型、杀虫谱等具有多样性。中国地域辽阔，地理、生态与气候条件复杂，具有丰富的生物多样性。作者从东北地区自然生态环境中死亡玉米螟幼虫虫体分离出一株杀玉米螟幼虫和尖音库蚊幼虫的高毒力菌株，并对其形态、晶体蛋白、血清型分类及杀虫毒力等生物学特性进行了系统的研究，研究结果如下。
1 材料与方法
1．1 供试菌株
标准菌株有苏云金亚种(H1)、幕虫亚种(HH1)以色列亚种(HH14)、HD-l(HH3ab)、阿莱亚种(HH3ac)、鲇泽亚种(HH7)、库斯塔克亚种(HH3abc)、猝倒亚种(HH4ab)、蜡螟亚种(HH5ab)。用于生理生化特性及H—血清型鉴定，均为本实验室保存。苏云金芽孢杆菌HB-3为本实验室从自然死亡玉米螟幼虫分离获得。
1．2 供试昆虫
玉米螟(Ostrinia．furnacalis Guenee)初龄幼虫、尖音库蚊(Culexpipiem Linnaeus)3龄幼虫，均为沈阳化工研究院农药生物测定中心的室内饲养敏感品系。
1．3培养基和试剂
LB固体培养基：酵母浸膏0．5％、蛋白胨1．0％、琼脂1．8％、NaCll．0％，pH7．0。LB液体培养基：酵母浸膏0．5％，蛋白胨1．0％，NaCl 1．0％，pH7．0。LB半固体培养基：酵母浸膏0．25％，蛋白胨0．5％，NaCl 0．5％，琼脂0．2％一0．3％，pH7．0。晶体蛋白裂解液：10g／LSDS，2％p—巯基乙醇(体积分数)，6mol／L尿素，pH 10．0。
1．4培养与观察
将冰箱保存的斜面菌种活化后接种到LB固体培养基中，30℃培养18—24h，观察菌落生长情况；取25 mLLB液体培养基于250 mL三角瓶中并接种，置30℃恒温摇床，230r／min振荡培养8 h后涂片镜检。观察菌体的运动性及鞭毛情况。
1．5 伴胞晶体的分离纯化及晶体蛋白浓度的测定
参照王瑛等的液体双相法，进行伴孢晶体的分离和纯化。发酵液中晶体蛋白浓度测定参照顾真荣，彭中允方法，将提纯的晶体配成2．0 mg／mL浓度的母液，稀释成一定梯度浓度后，经过离心处理，制成标准晶体液，用紫外吸收法测定ODH280。值，绘制晶体量与光密度值的标准曲线。将发酵液制备成样品晶孢液后按照标准晶体液的处理方法处理后，用紫外吸收法测定ODH280值。
1．6 生物测定
将纯化晶体和孢晶混合物制成不同浓度的感染液，测定对玉米螟和尖音库蚊的室内毒力。其中玉米螟的生物测定采用感染饲料法，每组供试幼虫30头，每个处理3次重复。于25℃饲养48h，调查死亡头数，计算LC280。尖音库蚊的生物测定参照陈在饵等的方法进行，每组供试幼虫30头，每个处理3次重复。于25℃饲养48h，调查死亡数量，计算LC50。
1．7 生理生化试验及H-血清型鉴定
按高秀梨方法进行。
1．8 晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析
SDS-PAGE凝胶制备参照F．奥斯伯的方法，浓缩胶和分离胶浓度分别为4％和10％。标准分子量蛋白组成为：116 kDa、66kDa、45kDa、25kDa和14kDa。在晶体样品中加人等量的样品缓冲液混匀，沸水煮3～5 min。10 000 r／min离心2 min，取上清液上样。采用恒压电泳，浓缩胶中电压为100V；分离胶中电压为150V。染色，脱色，根据标准蛋白计算分子量。
2 结果
2．1 形态与培养特征
HB-3菌株革兰氏反应阳性，营养细胞杆状，两端钝圆，单生、双联体或以双联体为单位连成短链状，菌体大小(1．08～1．30)μmX(2．5～3．18)μm，芽孢椭圆形，孢囊微膨大，有的近中生，有的居于菌体一端(较少)，大小为(0．73—1．10)btmX(1．40～1．95)pm，晶体有菱形和方形两种(图1)，菱形晶体的大小为(0．72～0．85)pmX(1．02～1．36)μm，方形晶体大小为(1．07～1．19)μmX(1．06一1．23)μm，周生鞭毛，运动活跃。在平板培养基上培养，菌落为圆形，白色，边缘不光滑，不透明。
2．2 晶体蛋白浓度
在紫外分光光度计上测定样品280 nm下的吸光值为0．748，根据标准曲线计算出其晶体蛋白浓度可达5．84mg／mL。
2．3 毒力测定结果
通过生物测定方法考察了HB-3菌株的纯化晶体和孢晶混合物对玉米螟、尖音库蚊的毒力。该菌株对玉米螟有较高的毒力，纯化晶体和孢晶混合物的LC50。值分别为5．82μg／mL。和5．94μg／mL。对尖音库蚊有一定的毒力。纯化晶体和孢晶混合物的LC50值分别为16．59μg／mL。和17．50μg／mL。(表1)。
2．4 生理生化试验及H—血清型鉴定结果
按照常规方法对菌株的10项生理生化性状进行了研究，供试全部标准菌株基本都可重复原始性状。结果见表2(附后)。
从表2中可以看出，HB-3菌株在其生长代谢过程中产生淀粉酶、蛋白酶、尿酶，不产生卵磷脂酶，可 以利用七叶灵、甘露糖、蔗糖、水杨苷、葡萄糖，并可生成色素。各项反应结果与标准菌株相比较，不难看出HB-3菌株与蜡螟亚种(Haab)的生化反应结果最为接近，仅菌膜的结果不一致。而与其他标准菌株相比则有较大差异。因此，初步断定该菌株属于蜡螟亚种。
采用标准菌株H1—H14与HB-3进行了交叉凝集试验和交叉吸收试验(表3)。
通过标准菌株H1—H14与HB-3的交叉凝集试验发现，HB-3只与蜡螟亚种(Haab)发生凝聚反应。从而初步断定HB-3菌株与蜡螟亚种(H5ab具有相同的鞭毛抗原因子。从表3可以看出，HB-3与蜡螟亚种(H5ab)发生凝集反应的凝集效价为20 480。从交叉凝集吸收试验结果(表3)中可以看出标准抗血清H5ab被HB-3菌株的鞭毛抗原饱和后，不再与标准菌株的鞭毛抗原发生凝集反应；同样当HB-3菌株的抗血清被相应的标准菌株的鞭毛抗原饱和后，也不再与其本身的鞭毛抗原起反应。说明HB-3菌株与其相对应的标准菌株蜡螟亚种(H5ab)具有完全相同的鞭毛抗原因子。因此，可以确定菌株HB-3属苏云金芽孢杆菌血清型H5AB。
2．5 晶体蛋白SDS—PAGE分析结果
通过与标准蛋白带比较，可知HB-3菌株晶体蛋白主要由4种多肽组成，其分子量分别为133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa(图2)。根据查阅资料”1，产生菱形和方形晶体的Bt菌株，其晶体蛋白成分主要为130～140 kDa、70～80 kDa，因此认为133 kDa、65 kDa为该晶体蛋白的活性成分。
3 讨论
本研究从自然死亡的玉米螟幼虫体内分离到的HB-3菌株不仅对鳞翅目昆虫具有较高毒力，同时还对尖音库蚊幼虫也表现出一定的毒力，表明从自然界中的死亡虫体中分离苏云金芽孢杆菌是一种行之有效的方法，同时也说明从虫尸内筛选高毒力菌株并不一定要从目标昆虫体内分离。
关于晶体蛋白的提纯方法普遍采用的主要有3种：液体双相法、不连续蔗糖密度梯度离心法和碱裂解法。采用液体双相分离法可以获得理想纯度的晶体，但影响该法提纯纯度的因素较多；应用不连续蔗糖密度梯度离心法提取晶体蛋白量较少且最适的蔗糖浓度梯度不易控制，孢晶混合物不能完全分离，而且离心时间长；碱裂解法操作简便，时间短，蛋白提取量大，但蛋白纯度较低，不适合晶体蛋白特性的研究，比较适合大量提取。
本试验中认为133kDa、65kDa为该晶体蛋白的活性成分，主要根据喻子牛的《苏云金芽孢杆菌制剂的生产和应用》一书中关于Bt伴胞晶体的毒力机理部分的相关说明。书中认为一般分子量为27kDa左右的多肽主要存在于不规则形伴胞晶体中，而该类晶体一般对鳞翅目无毒，对鞘翅目有高毒力，而根据本试验观察的晶体形态和毒力测定结果，初步认为谱带中的23kDa的蛋白并不是该菌的活性成分。45kDa的蛋白多肽未见报道，因此认为分子量为45kDa和23kDa的蛋白可能是由于大分子量的蛋白降解引起的。
毒力测定结果表明，该菌株表明纯化晶体的LC50略高于孢晶混合物，说明该菌株的活性成分主要为晶体蛋白，芽孢低毒或无毒。这与很多已发表的研究成果有所不同，可能与菌株间存在的差异有关。
关键词 苏云金芽孢杆菌； 晶体蛋白； 毒力测定； 生物学
中图分类号 S 476．11
苏云金芽孢杆菌(acillusthuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性反应细菌，杆状，能形成内生芽孢。该菌在自然界普遍存在，资源丰富，不同地理生态环境中其群体的分布特点、基因类型、杀虫谱等具有多样性。中国地域辽阔，地理、生态与气候条件复杂，具有丰富的生物多样性。作者从东北地区自然生态环境中死亡玉米螟幼虫虫体分离出一株杀玉米螟幼虫和尖音库蚊幼虫的高毒力菌株，并对其形态、晶体蛋白、血清型分类及杀虫毒力等生物学特性进行了系统的研究，研究结果如下。
1 材料与方法
1．1 供试菌株
标准菌株有苏云金亚种(H1)、幕虫亚种(HH1)以色列亚种(HH14)、HD-l(HH3ab)、阿莱亚种(HH3ac)、鲇泽亚种(HH7)、库斯塔克亚种(HH3abc)、猝倒亚种(HH4ab)、蜡螟亚种(HH5ab)。用于生理生化特性及H—血清型鉴定，均为本实验室保存。苏云金芽孢杆菌HB-3为本实验室从自然死亡玉米螟幼虫分离获得。
1．2 供试昆虫
玉米螟(Ostrinia．furnacalis Guenee)初龄幼虫、尖音库蚊(Culexpipiem Linnaeus)3龄幼虫，均为沈阳化工研究院农药生物测定中心的室内饲养敏感品系。
1．3培养基和试剂
LB固体培养基：酵母浸膏0．5％、蛋白胨1．0％、琼脂1．8％、NaCll．0％，pH7．0。LB液体培养基：酵母浸膏0．5％，蛋白胨1．0％，NaCl 1．0％，pH7．0。LB半固体培养基：酵母浸膏0．25％，蛋白胨0．5％，NaCl 0．5％，琼脂0．2％一0．3％，pH7．0。晶体蛋白裂解液：10g／LSDS，2％p—巯基乙醇(体积分数)，6mol／L尿素，pH 10．0。
1．4培养与观察
将冰箱保存的斜面菌种活化后接种到LB固体培养基中，30℃培养18—24h，观察菌落生长情况；取25 mLLB液体培养基于250 mL三角瓶中并接种，置30℃恒温摇床，230r／min振荡培养8 h后涂片镜检。观察菌体的运动性及鞭毛情况。
1．5 伴胞晶体的分离纯化及晶体蛋白浓度的测定
参照王瑛等的液体双相法，进行伴孢晶体的分离和纯化。发酵液中晶体蛋白浓度测定参照顾真荣，彭中允方法，将提纯的晶体配成2．0 mg／mL浓度的母液，稀释成一定梯度浓度后，经过离心处理，制成标准晶体液，用紫外吸收法测定ODH280。值，绘制晶体量与光密度值的标准曲线。将发酵液制备成样品晶孢液后按照标准晶体液的处理方法处理后，用紫外吸收法测定ODH280值。
1．6 生物测定
将纯化晶体和孢晶混合物制成不同浓度的感染液，测定对玉米螟和尖音库蚊的室内毒力。其中玉米螟的生物测定采用感染饲料法，每组供试幼虫30头，每个处理3次重复。于25℃饲养48h，调查死亡头数，计算LC280。尖音库蚊的生物测定参照陈在饵等的方法进行，每组供试幼虫30头，每个处理3次重复。于25℃饲养48h，调查死亡数量，计算LC50。
1．7 生理生化试验及H-血清型鉴定
按高秀梨方法进行。
1．8 晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析
SDS-PAGE凝胶制备参照F．奥斯伯的方法，浓缩胶和分离胶浓度分别为4％和10％。标准分子量蛋白组成为：116 kDa、66kDa、45kDa、25kDa和14kDa。在晶体样品中加人等量的样品缓冲液混匀，沸水煮3～5 min。10 000 r／min离心2 min，取上清液上样。采用恒压电泳，浓缩胶中电压为100V；分离胶中电压为150V。染色，脱色，根据标准蛋白计算分子量。
2 结果
2．1 形态与培养特征
HB-3菌株革兰氏反应阳性，营养细胞杆状，两端钝圆，单生、双联体或以双联体为单位连成短链状，菌体大小(1．08～1．30)μmX(2．5～3．18)μm，芽孢椭圆形，孢囊微膨大，有的近中生，有的居于菌体一端(较少)，大小为(0．73—1．10)btmX(1．40～1．95)pm，晶体有菱形和方形两种(图1)，菱形晶体的大小为(0．72～0．85)pmX(1．02～1．36)μm，方形晶体大小为(1．07～1．19)μmX(1．06一1．23)μm，周生鞭毛，运动活跃。在平板培养基上培养，菌落为圆形，白色，边缘不光滑，不透明。
2．2 晶体蛋白浓度
在紫外分光光度计上测定样品280 nm下的吸光值为0．748，根据标准曲线计算出其晶体蛋白浓度可达5．84mg／mL。
2．3 毒力测定结果
通过生物测定方法考察了HB-3菌株的纯化晶体和孢晶混合物对玉米螟、尖音库蚊的毒力。该菌株对玉米螟有较高的毒力，纯化晶体和孢晶混合物的LC50。值分别为5．82μg／mL。和5．94μg／mL。对尖音库蚊有一定的毒力。纯化晶体和孢晶混合物的LC50值分别为16．59μg／mL。和17．50μg／mL。(表1)。
2．4 生理生化试验及H—血清型鉴定结果
按照常规方法对菌株的10项生理生化性状进行了研究，供试全部标准菌株基本都可重复原始性状。结果见表2(附后)。
从表2中可以看出，HB-3菌株在其生长代谢过程中产生淀粉酶、蛋白酶、尿酶，不产生卵磷脂酶，可 以利用七叶灵、甘露糖、蔗糖、水杨苷、葡萄糖，并可生成色素。各项反应结果与标准菌株相比较，不难看出HB-3菌株与蜡螟亚种(Haab)的生化反应结果最为接近，仅菌膜的结果不一致。而与其他标准菌株相比则有较大差异。因此，初步断定该菌株属于蜡螟亚种。
采用标准菌株H1—H14与HB-3进行了交叉凝集试验和交叉吸收试验(表3)。
通过标准菌株H1—H14与HB-3的交叉凝集试验发现，HB-3只与蜡螟亚种(Haab)发生凝聚反应。从而初步断定HB-3菌株与蜡螟亚种(H5ab具有相同的鞭毛抗原因子。从表3可以看出，HB-3与蜡螟亚种(H5ab)发生凝集反应的凝集效价为20 480。从交叉凝集吸收试验结果(表3)中可以看出标准抗血清H5ab被HB-3菌株的鞭毛抗原饱和后，不再与标准菌株的鞭毛抗原发生凝集反应；同样当HB-3菌株的抗血清被相应的标准菌株的鞭毛抗原饱和后，也不再与其本身的鞭毛抗原起反应。说明HB-3菌株与其相对应的标准菌株蜡螟亚种(H5ab)具有完全相同的鞭毛抗原因子。因此，可以确定菌株HB-3属苏云金芽孢杆菌血清型H5AB。
2．5 晶体蛋白SDS—PAGE分析结果
通过与标准蛋白带比较，可知HB-3菌株晶体蛋白主要由4种多肽组成，其分子量分别为133kDa、65 kDa、45 kDa和23 kDa(图2)。根据查阅资料”1，产生菱形和方形晶体的Bt菌株，其晶体蛋白成分主要为130～140 kDa、70～80 kDa，因此认为133 kDa、65 kDa为该晶体蛋白的活性成分。
3 讨论
本研究从自然死亡的玉米螟幼虫体内分离到的HB-3菌株不仅对鳞翅目昆虫具有较高毒力，同时还对尖音库蚊幼虫也表现出一定的毒力，表明从自然界中的死亡虫体中分离苏云金芽孢杆菌是一种行之有效的方法，同时也说明从虫尸内筛选高毒力菌株并不一定要从目标昆虫体内分离。
关于晶体蛋白的提纯方法普遍采用的主要有3种：液体双相法、不连续蔗糖密度梯度离心法和碱裂解法。采用液体双相分离法可以获得理想纯度的晶体，但影响该法提纯纯度的因素较多；应用不连续蔗糖密度梯度离心法提取晶体蛋白量较少且最适的蔗糖浓度梯度不易控制，孢晶混合物不能完全分离，而且离心时间长；碱裂解法操作简便，时间短，蛋白提取量大，但蛋白纯度较低，不适合晶体蛋白特性的研究，比较适合大量提取。
本试验中认为133kDa、65kDa为该晶体蛋白的活性成分，主要根据喻子牛的《苏云金芽孢杆菌制剂的生产和应用》一书中关于Bt伴胞晶体的毒力机理部分的相关说明。书中认为一般分子量为27kDa左右的多肽主要存在于不规则形伴胞晶体中，而该类晶体一般对鳞翅目无毒，对鞘翅目有高毒力，而根据本试验观察的晶体形态和毒力测定结果，初步认为谱带中的23kDa的蛋白并不是该菌的活性成分。45kDa的蛋白多肽未见报道，因此认为分子量为45kDa和23kDa的蛋白可能是由于大分子量的蛋白降解引起的。
毒力测定结果表明，该菌株表明纯化晶体的LC50略高于孢晶混合物，说明该菌株的活性成分主要为晶体蛋白，芽孢低毒或无毒。这与很多已发表的研究成果有所不同，可能与菌株间存在的差异有关。