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摘要：为了提高猪瘟活疫苗的产品质量，本研究采用改良保护剂分别与猪瘟组织毒和猪瘟细胞毒进行冻干试验，成功试制2种猪瘟活疫苗。试制的2种猪瘟活疫苗，性状和溶解情况良好，室温保存2d和溶解后室温放置4h对产品效价变化不明显，均达到规程标准要求。
关键词：猪瘟活疫苗；品质；提升
猪瘟活疫苗活疫苗按规程工艺生产产品出现溶解状态不佳、长途运输品质下降，我公司经过技术改良取得较好效果，现将研究结果报告如下：
1.材料
1.1
毒种
猪瘟病毒兔化弱毒株（C株）由中国兽医药品监察所鉴定并提供，瑞普（保定）生物药业有限公司结合优良的原材料生产，经全面鉴定为合格，置于-70℃保存供疫苗生产用。
1.2
实验动物
选用营养良好，体重1.5～3 kg家兔。购入后，家兔应隔离饲养观察30 d以上。家兔接种前，至少应测温观察5d，每日上、下午各测温1次。选用体温正常、体温波动小于0.5℃的家兔。
1.3
冻干保护剂
冻干脱脂乳购自新西兰；多聚蛋白胨购自日本株式会社；蔗糖、吐温-80等购自北京益利公司。
1.4
其他试剂与设备
MEM培养基购自Gibco公司；猪瘟抗原检测试剂盒购自北京爱德仕公司；猪瘟专用新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶购自Gibco公司。
2.方法
2.1
半成品制备
2.1.1
猪瘟病毒组织毒制备
按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）以下简称《规程》要求接种健康家兔收获脾淋组织制备半成品。
2.1.2
猪瘟细胞毒制备
猪瘟细胞毒接种易感ST细胞，收获培养物，制备细胞毒半成品。
2.2
保护剂的配制
2.2.1
牛奶脱脂乳保护剂配制按照《规程》附录426页所述方法进行配制，经121℃灭菌15 min备用。
2.2.2
改良保护剂配制
将蔗糖、多聚蛋白胨、吐温-80和脱脂乳等按照一定比例配制而成，制备3批保护剂，经除菌后备用。
2.3
疫苗配制
2.3.1
组织毒疫苗的配制
在无菌操作下剔除脂肪组织。将检验合格的制苗组织称重、剪碎，然后加入适量改良保护剂混合4～8℃恒温研磨并控制产品粒径在0.2 μm，滤过扣除沉渣量，再按实际组织量补足剩余保护剂，进行定量分装冻干。并设立原工艺疫苗（《规程》）对照。
2.3.2
细胞毒疫苗的配制将检验合格的猪瘟病毒细胞毒病毒液混合于同一无菌容器内，按照适量比例添加改良保护剂，充分混合后进行定量分装与冻干。并设立原工艺疫苗对照。
2.4
疫苗检验
2.4.1
性状
观察冻干品是否为海绵状疏松团块物质性状。
2.4.2
溶解性
加入相应疫苗稀释液测定其完全溶解的时间并观察溶解后2h物理状态是否改变（不溶物或沉淀）。
2.4.3
环境因素对疫苗的影响测定-15℃放置1年、室温（25℃）放置2d以及溶解后室温放置4h产品的效价。
2.4.4
其它检验
按照原质量标准要求进行其余各项检验。
3.结果
3.1
3批疫苗的性状和溶解情况
3.1.1
性状
结果（如图1～2）。从图中可以看出，猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源），物理性状良好，均为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离。
3.1.2
溶解情况
从表1可以看出，改良保护剂组均能有效地改善猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源）的溶解状态，溶解后无沉淀或漂浮物，而对照品均有不同程度的沉淀，猪瘟活疫苗（兔源）对照品还有漂浮物。
3.2
环境因素对产品效价的影响
从表2可以看出改良保护剂的猪瘟活疫苗（兔源）、猪瘟活疫苗（细胞源）室温放置2d；溶解后能在室温放置4h产品滴度均不下降，而对照品均有不同程度的下降。
3.3
其它检验结果（见表3）
3批猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源）、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分和真空度检验均符合规程要求。
4.分析与讨论
4.1
产品溶解性
产品的溶解性直接影响产品应用方便程度和应用效果。在长期临床应用研究中我们发现猪瘟组织苗（脾淋苗）在使用常常出现情况：溶解速度慢常常需要几分钟，溶解以后出现有漂浮物和沉淀的情况。经过我们观察，初步将漂浮物分为二类，一类是不相容的油滴，另一类为絮状结缔组织。针对油状漂浮物，一方面采用捣碎前的脂肪组织、结缔组织分离，另一方面，采用冷处理分离技术有效分离油状物和结缔组织。出现沉淀和溶解速度慢，这可能与组织颗粒大，冻干品过于致密相关，病毒提取工艺不佳，在本研究中我们一方面控制捣碎颗粒大小0.2 μm以内，另一方面采用增溶剂保证病毒颗粒充分溶出，严禁大颗粒滤过。而猪瘟细胞苗溶解的主要问题是有沉淀，这可能与抗原液的pH值相关，研究中经过pH调节和增溶剂等的调整，改进产品未见溶解后有沉淀。
4.2
产品的保存与使用
产品严格按照质量标准的要求进行保藏和使用是可以保证产品质量的。但是我们在运输、保存和使用中，常常保存温度略有上升达不到相关要求，造成产品质量下降。这种产品质量可能由于产品保存温度上升，蛋白质发生凝聚、氧化反应和水解反应等作用下，导致产品中病毒蛋白部分失活，从而使得产品质量下降。而这种温度升高，经过估算相当于室温放置1 d左右，溶解后室温放置2h以内。经抗氧化成分和蛋白增溶剂的添加，室温放置2 d或室温溶解4h后检测产品质量仍合格，说明该方法在外界环境作用下有一定维持产品质量的作用，一定程度上满足了养殖生产的实际需要。
5.结论
本试验成功地研制出一种冻干保护剂。应用该保护剂中试生产的3批猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源），全部通过无菌、支原体、鉴别、安全、效力、剩余水分、真空度等各项检验，均符合《规程》要求。
中试生产的3批猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源）显示出良好的性状和溶解性能，对外界因素有一定抵抗力，室温放置2d或室温溶解4h对产品效价影响不明显，均达到规程要求。
关键词：猪瘟活疫苗；品质；提升
猪瘟活疫苗活疫苗按规程工艺生产产品出现溶解状态不佳、长途运输品质下降，我公司经过技术改良取得较好效果，现将研究结果报告如下：
1.材料
1.1
毒种
猪瘟病毒兔化弱毒株（C株）由中国兽医药品监察所鉴定并提供，瑞普（保定）生物药业有限公司结合优良的原材料生产，经全面鉴定为合格，置于-70℃保存供疫苗生产用。
1.2
实验动物
选用营养良好，体重1.5～3 kg家兔。购入后，家兔应隔离饲养观察30 d以上。家兔接种前，至少应测温观察5d，每日上、下午各测温1次。选用体温正常、体温波动小于0.5℃的家兔。
1.3
冻干保护剂
冻干脱脂乳购自新西兰；多聚蛋白胨购自日本株式会社；蔗糖、吐温-80等购自北京益利公司。
1.4
其他试剂与设备
MEM培养基购自Gibco公司；猪瘟抗原检测试剂盒购自北京爱德仕公司；猪瘟专用新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶购自Gibco公司。
2.方法
2.1
半成品制备
2.1.1
猪瘟病毒组织毒制备
按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）以下简称《规程》要求接种健康家兔收获脾淋组织制备半成品。
2.1.2
猪瘟细胞毒制备
猪瘟细胞毒接种易感ST细胞，收获培养物，制备细胞毒半成品。
2.2
保护剂的配制
2.2.1
牛奶脱脂乳保护剂配制按照《规程》附录426页所述方法进行配制，经121℃灭菌15 min备用。
2.2.2
改良保护剂配制
将蔗糖、多聚蛋白胨、吐温-80和脱脂乳等按照一定比例配制而成，制备3批保护剂，经除菌后备用。
2.3
疫苗配制
2.3.1
组织毒疫苗的配制
在无菌操作下剔除脂肪组织。将检验合格的制苗组织称重、剪碎，然后加入适量改良保护剂混合4～8℃恒温研磨并控制产品粒径在0.2 μm，滤过扣除沉渣量，再按实际组织量补足剩余保护剂，进行定量分装冻干。并设立原工艺疫苗（《规程》）对照。
2.3.2
细胞毒疫苗的配制将检验合格的猪瘟病毒细胞毒病毒液混合于同一无菌容器内，按照适量比例添加改良保护剂，充分混合后进行定量分装与冻干。并设立原工艺疫苗对照。
2.4
疫苗检验
2.4.1
性状
观察冻干品是否为海绵状疏松团块物质性状。
2.4.2
溶解性
加入相应疫苗稀释液测定其完全溶解的时间并观察溶解后2h物理状态是否改变（不溶物或沉淀）。
2.4.3
环境因素对疫苗的影响测定-15℃放置1年、室温（25℃）放置2d以及溶解后室温放置4h产品的效价。
2.4.4
其它检验
按照原质量标准要求进行其余各项检验。
3.结果
3.1
3批疫苗的性状和溶解情况
3.1.1
性状
结果（如图1～2）。从图中可以看出，猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源），物理性状良好，均为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离。
3.1.2
溶解情况
从表1可以看出，改良保护剂组均能有效地改善猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源）的溶解状态，溶解后无沉淀或漂浮物，而对照品均有不同程度的沉淀，猪瘟活疫苗（兔源）对照品还有漂浮物。
3.2
环境因素对产品效价的影响
从表2可以看出改良保护剂的猪瘟活疫苗（兔源）、猪瘟活疫苗（细胞源）室温放置2d；溶解后能在室温放置4h产品滴度均不下降，而对照品均有不同程度的下降。
3.3
其它检验结果（见表3）
3批猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源）、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分和真空度检验均符合规程要求。
4.分析与讨论
4.1
产品溶解性
产品的溶解性直接影响产品应用方便程度和应用效果。在长期临床应用研究中我们发现猪瘟组织苗（脾淋苗）在使用常常出现情况：溶解速度慢常常需要几分钟，溶解以后出现有漂浮物和沉淀的情况。经过我们观察，初步将漂浮物分为二类，一类是不相容的油滴，另一类为絮状结缔组织。针对油状漂浮物，一方面采用捣碎前的脂肪组织、结缔组织分离，另一方面，采用冷处理分离技术有效分离油状物和结缔组织。出现沉淀和溶解速度慢，这可能与组织颗粒大，冻干品过于致密相关，病毒提取工艺不佳，在本研究中我们一方面控制捣碎颗粒大小0.2 μm以内，另一方面采用增溶剂保证病毒颗粒充分溶出，严禁大颗粒滤过。而猪瘟细胞苗溶解的主要问题是有沉淀，这可能与抗原液的pH值相关，研究中经过pH调节和增溶剂等的调整，改进产品未见溶解后有沉淀。
4.2
产品的保存与使用
产品严格按照质量标准的要求进行保藏和使用是可以保证产品质量的。但是我们在运输、保存和使用中，常常保存温度略有上升达不到相关要求，造成产品质量下降。这种产品质量可能由于产品保存温度上升，蛋白质发生凝聚、氧化反应和水解反应等作用下，导致产品中病毒蛋白部分失活，从而使得产品质量下降。而这种温度升高，经过估算相当于室温放置1 d左右，溶解后室温放置2h以内。经抗氧化成分和蛋白增溶剂的添加，室温放置2 d或室温溶解4h后检测产品质量仍合格，说明该方法在外界环境作用下有一定维持产品质量的作用，一定程度上满足了养殖生产的实际需要。
5.结论
本试验成功地研制出一种冻干保护剂。应用该保护剂中试生产的3批猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源），全部通过无菌、支原体、鉴别、安全、效力、剩余水分、真空度等各项检验，均符合《规程》要求。
中试生产的3批猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟活疫苗（细胞源）显示出良好的性状和溶解性能，对外界因素有一定抵抗力，室温放置2d或室温溶解4h对产品效价影响不明显，均达到规程要求。