【摘 要】
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目的构建特异性结合乙型肝炎病毒X基因启动子(Hepatitis B virus X promoter,HBV Xp)的人工转录因子真核表达载体,并与拉米夫定(3TC)体外抗乙肝病毒效果进行比较研究。方法利
【机 构】
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重庆医科大学附属第一医院肝胆外科,璧山县人民医院肝胆外科,
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目的构建特异性结合乙型肝炎病毒X基因启动子(Hepatitis B virus X promoter,HBV Xp)的人工转录因子真核表达载体,并与拉米夫定(3TC)体外抗乙肝病毒效果进行比较研究。方法利用Zine finger tools 3.0软件设计特异性结合HBV Xp的锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)并融合抑制性效应结构域kRAB,全基因合成后载入真核表达载体pc DNA3.1(+),构建重组质粒pc DNA3.1(+)-nls-ZFP-kRAB-Flag(ATF)、pc DNA3.1(+)-nls-ZFP-Flag(ZFP1)、pc DNA3.1(+)-nls-kRAB-Flag(ZFP2),通过酶切、测序鉴定重组质粒的正确性,Western blot和细胞免疫荧光鉴定重组质粒在Hep G2细胞表达情况。将重组质粒转染Hep G2.2.15细胞,设空白组(Blank组)、ATF组、ZFP1组、ZFP2组、空质粒组(Empty vector组)和拉米夫定组(3TC组),分别培养2、6、10 d,用Western blot、FQ-PCR、ELISA分别检测各组HBx蛋白、HBV DNA、上清中HBs Ag和HBe Ag的表达情况。结果重组质粒成功构建且能在Hep G2细胞中表达;ATF组抑制Hep G2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05),且6 d和10 d抑制作用强于2 d;3TC组亦能抑制Hep G2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达(P<0.05)。ATF组能抑制上清中HBs Ag,HBe Ag的分泌,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05);3TC组亦能抑制上清中HBs Ag,HBe Ag的分泌(P<0.05)。结论人工设计的特异性ATF在真核细胞中能正常表达,并能有效发挥抑制HBV的作用,且抑制作用强于拉米夫定。
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