论文部分内容阅读
摘 要：目的：建立以HPLC法测定生物素的含量。检测方法：色谱柱为VP－ODS，流动相：乙腈-磷酸-0.05%三氟乙酸(250:1:750)，检测波长：210nm，流速为1.0ml/min,进样量为20ul。结果：生物素检测浓度的线性范围为0.05～0.30mg/ml(r=0.9999)；平均回收率为99.9%，RSD＝0.53%。结论：本方法操作简便、精密度好、结果准确。
关键词
关键词：高效液相色谱法 生物素 含量测定
前言
生物素(d-Biotin)又称维生素H或辅酶R，主要作为各种羧化酶的辅助因子。对糖、脂肪、蛋白质和核酸等代谢有重要意义，广泛应用于医疗，多维制剂及饲料添加剂等方面。已载入美国及欧州等国药典，含量测定均采用化学滴定法。本文建立了测定生物素的HPLC法，操作简便，结果准确，速度比较快。
实验部分
一、主要仪器与试剂
1.仪器
高效液相色谱仪：Agilent 1100 Chemstation 色谱工作站
2.试剂
乙腈( 浙江临海市浙东特种试剂厂，色谱纯)
三氟乙酸(上海化学试剂厂，分析纯)
磷酸（杭州化学试剂厂，分析纯）
3.试验样品
生物素对照品(中国药品生物制品鉴定所，含量100%，批号：1029*1-0001)。
生物素样品(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20070826，20070827，20070831)。
二、实验方法
1.色谱条件
高效液相色谱仪：安捷伦（Agilent）1100 （LC）
色谱柱：VP-ODS色谱柱(4.6 mm×250mm,5um)；
流动相：取乙腈250ml，加磷酸1ml，再加入0.05%三氟乙酸溶液750ml，混合均匀，过滤；
检测器：紫外检测器
检测波长：210nm；
进样体积：20μl
柱温：室温。
2.测试方法
精密称取生物素样品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。分别将上述两种溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算主色谱峰峰面积，用外标法计算生物素含量。
三、方法的确定
实验方法的确定涉及到多个方面，例如色谱柱、流动相、检测波长、柱温的选择与确定等。本文重点阐述检测波长的选择与确定。
由于生物素结构具有有一定的极性，因此选择采用反相色谱法，色谱柱选择常用的ODS柱，尺寸4.6 mm×250mm,填料粒径5um。
1.检测波长的确定
根据生物素本身紫外吸收的特性，使检测波长尽量靠近生物素最大吸收波长且尽可能避免溶剂截止波长的影响。
1.1 溶剂截止波长的影响
我们所使用的流动相和溶解样品涉及的溶剂为乙腈，由于乙腈的截止波长为190nm，因此我们应该把波长的选择放在大于或等于210nm的范围。
1.2生物素的紫外吸收特性
当然波长的测定主要还是依赖于待测试样品的紫外吸收特征来决定的。为测定生物素样品的吸收特性，我们使用二级管阵列检测器（DAD检测器）进行测定得到生物素标准品的紫外吸收色谱图。生物素的最大吸收波长位于198nm左右,从该波长开始随着波长增大，吸收变弱。高于225nm时，生物素没有明显的紫外吸收迹象。198nm～215nm是生物素紫外吸收相对较强区域。结合流动相中所含溶剂乙腈截止波长的影响。故选择范围应大于等于210nm的波长。在210 nm ～215nm区域下生物素的最大吸收在210nm，故最后选择210nm。
2. 流动相
流动相：采用乙腈-磷酸-0.05%三氟乙酸溶液(250：1：750)为流动相。
取空白溶液(流动相)注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱图。将空白溶液的色谱图与样品溶液的色谱图进行比较，结果显示空白溶液对生物素的测定无干扰。
取生物素对照品溶液(2.2测试方法)注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果该色谱条件下生物素峰的较高的柱效(本次为7943理论塔板数)和较低的拖尾因子(本次为1.146)：
四、方法验证
1.线性试验
精密称取生物素对照品25mg置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。分别精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml各置10ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。浓度分别为0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.15 mg/ml、0.20 mg/ml、0.25 mg/ml、0.30 mg/ml（涵盖范围相当工作浓度的25%至工作浓度的150%），分别取上述溶液20ul注入色谱仪进样测定，记录色谱图。以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析，计算线性回归方程，相关系数。计算的结果见下表。
经回归分析可得，生物素样品的线性回归方程为：A=8246.29 C + 15.73 (相关系数r=0.9999),线性范围： 0.05～0.30mg/ml
以上结果表明，在样品浓度0.05～0.30mg/ml（相当于工作浓度的25%至工作浓度的150%）范圍内线性关系良好。
2. 准确度（回收率试验）
取某个已知含量的样品，精密称取，加流动相溶解分别制成含生物素为0.16、0.20、0.24mg/ml的溶液，每个浓度各进样三次，计算生物素含量的平均回收率、生物素含量相对标准偏差（RSD）。计算结果见下表。
计算后得到回收率在99.0%-100.4%范围内，且平均回收率为99.9%。 以上结果表明，采用HPLC法测定生物素的含量，有较好的准确度，回收率接近百分之百，且在3个浓度水平9次测定的相对标准偏差较小，RSD%仅为0.53%，可满足日常检测需要。
3. 精密度
精密称取生物素样品约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，同法配制得对照品溶液，分别进样测定，记录色谱图，读取主峰面积，用外标法计算生物素含量。连续进样6次，記录色谱图。计算得峰面积RSD为0.39%，计算结果见下表。
以上结果表明，采用HPLC法测定生物素的含量，有较好的精密度。
4. 溶液稳定性试验
精密称取生物素样品约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。分别于室温放置0、4、8、16、24h后进样，记录色谱图，计算峰面积。得生物素峰面积的RSD为0.57%，表明生物素样品溶液在24h内稳定，且没有发现有明显的降解产生。可以在该时间范围内测试样品。
5.专属性试验
取样品溶液和对照品溶液分别按照程序中的测试方法将溶液注入高效液相色谱仪。记录色谱图。比较对照溶液的色谱图和样品溶液的色谱图，对照溶液中获得的色谱图主峰保留时间应与样品溶液中获得的色谱图的保留时间一致，试验证明两者是一致的（见图1、图2），符合要求。从以上试验可以看出样品和标准品主峰保留时间一致可以认为为同一物质，这就是鉴别。
6. 强力破坏试验
将样品置于不同破坏环境下进行破坏试验。检查色谱图变化情况，以观察在可能潜在的破坏条件下，该方法仍旧能有效分离主峰和其他不知名杂质。在氧化剂、还原剂进行破坏的条件下，色谱图和正常色谱条件下几乎没有差别，可以认为样品在氧化剂、还原剂存在条件下该测试方法几乎不受该类破坏条件的影响，能较好分离。在强碱（氢氧化钠溶液）、强酸（稀盐酸）条件下，生物素有一定程度的降解，不过仍能较好分离。在高热环境下生物素有一定的降解，但仍可分离。
五、 样品的测定
精密称取生物素样品（批号：20070826、20070827、20070831）约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得对照品溶液，分别进样测定，记录色谱图（如图1），用外标法计算生物素含量。计算结果见下表。
六 结论
1. 该方法测定生物素在0.05 mg/ml～0.30mg/ml（相当于工作浓度的25%至工作浓度的150%）浓度范围内有良好的线性关系，生物素样品的线性回归方程为：A=8246.29 C + 15.73，相关系数为0.9999。
2.该方法有良好的精密度，连续进样6次，计算得峰面积RSD为0.39%
3. 溶液室温放置0、4、8、16、24h后测定，峰面积的RSD为0.57%，溶液在24h内稳定，未发现有新的降解产物。
4.采用HPLC法测定本品含量回收率高，平均回收率为99.9%，RSD为0.53%。
5.国外药典采用化学法，本方法采用HPLC法，化学法精密度好，而HPLC法准确度高，尤其是在检测粗品时可选择HPLC法检测生物素的含量。
6.该方法测量生物素含量有比较好的专属性。理论塔板数比较高，并且峰型很好没有拖尾现象产生。
7.该方法的优点：检查速度快。基于验证考虑我们将该方法色谱分析时间执行得比较长，如果单纯出于测量速度的考虑，色谱分析时间大大缩短时间。比较符合生产企业的需要。
8. 该方法在强烈破坏条件下表现了比较好的耐用性。在氧化剂、还原剂存在条件下该测试方法几乎不受该类破坏条件的影响，能较好分离。在强碱（氢氧化钠溶液）、强酸（稀盐酸）条件下，生物素有一定程度的降解，不过仍能较好分离。
参考文献
(1) ICH Q2 Validation of Analysis Procedure.
(2)中国药典2005年版二部附录VD高效液相色谱法.
(3)中国药典2005年版二部附录XIX A 药品质量标准分析方法验证.
关键词
关键词：高效液相色谱法 生物素 含量测定
前言
生物素(d-Biotin)又称维生素H或辅酶R，主要作为各种羧化酶的辅助因子。对糖、脂肪、蛋白质和核酸等代谢有重要意义，广泛应用于医疗，多维制剂及饲料添加剂等方面。已载入美国及欧州等国药典，含量测定均采用化学滴定法。本文建立了测定生物素的HPLC法，操作简便，结果准确，速度比较快。
实验部分
一、主要仪器与试剂
1.仪器
高效液相色谱仪：Agilent 1100 Chemstation 色谱工作站
2.试剂
乙腈( 浙江临海市浙东特种试剂厂，色谱纯)
三氟乙酸(上海化学试剂厂，分析纯)
磷酸（杭州化学试剂厂，分析纯）
3.试验样品
生物素对照品(中国药品生物制品鉴定所，含量100%，批号：1029*1-0001)。
生物素样品(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20070826，20070827，20070831)。
二、实验方法
1.色谱条件
高效液相色谱仪：安捷伦（Agilent）1100 （LC）
色谱柱：VP-ODS色谱柱(4.6 mm×250mm,5um)；
流动相：取乙腈250ml，加磷酸1ml，再加入0.05%三氟乙酸溶液750ml，混合均匀，过滤；
检测器：紫外检测器
检测波长：210nm；
进样体积：20μl
柱温：室温。
2.测试方法
精密称取生物素样品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。分别将上述两种溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算主色谱峰峰面积，用外标法计算生物素含量。
三、方法的确定
实验方法的确定涉及到多个方面，例如色谱柱、流动相、检测波长、柱温的选择与确定等。本文重点阐述检测波长的选择与确定。
由于生物素结构具有有一定的极性，因此选择采用反相色谱法，色谱柱选择常用的ODS柱，尺寸4.6 mm×250mm,填料粒径5um。
1.检测波长的确定
根据生物素本身紫外吸收的特性，使检测波长尽量靠近生物素最大吸收波长且尽可能避免溶剂截止波长的影响。
1.1 溶剂截止波长的影响
我们所使用的流动相和溶解样品涉及的溶剂为乙腈，由于乙腈的截止波长为190nm，因此我们应该把波长的选择放在大于或等于210nm的范围。
1.2生物素的紫外吸收特性
当然波长的测定主要还是依赖于待测试样品的紫外吸收特征来决定的。为测定生物素样品的吸收特性，我们使用二级管阵列检测器（DAD检测器）进行测定得到生物素标准品的紫外吸收色谱图。生物素的最大吸收波长位于198nm左右,从该波长开始随着波长增大，吸收变弱。高于225nm时，生物素没有明显的紫外吸收迹象。198nm～215nm是生物素紫外吸收相对较强区域。结合流动相中所含溶剂乙腈截止波长的影响。故选择范围应大于等于210nm的波长。在210 nm ～215nm区域下生物素的最大吸收在210nm，故最后选择210nm。
2. 流动相
流动相：采用乙腈-磷酸-0.05%三氟乙酸溶液(250：1：750)为流动相。
取空白溶液(流动相)注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱图。将空白溶液的色谱图与样品溶液的色谱图进行比较，结果显示空白溶液对生物素的测定无干扰。
取生物素对照品溶液(2.2测试方法)注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果该色谱条件下生物素峰的较高的柱效(本次为7943理论塔板数)和较低的拖尾因子(本次为1.146)：
四、方法验证
1.线性试验
精密称取生物素对照品25mg置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。分别精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml各置10ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀。浓度分别为0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.15 mg/ml、0.20 mg/ml、0.25 mg/ml、0.30 mg/ml（涵盖范围相当工作浓度的25%至工作浓度的150%），分别取上述溶液20ul注入色谱仪进样测定，记录色谱图。以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析，计算线性回归方程，相关系数。计算的结果见下表。
经回归分析可得，生物素样品的线性回归方程为：A=8246.29 C + 15.73 (相关系数r=0.9999),线性范围： 0.05～0.30mg/ml
以上结果表明，在样品浓度0.05～0.30mg/ml（相当于工作浓度的25%至工作浓度的150%）范圍内线性关系良好。
2. 准确度（回收率试验）
取某个已知含量的样品，精密称取，加流动相溶解分别制成含生物素为0.16、0.20、0.24mg/ml的溶液，每个浓度各进样三次，计算生物素含量的平均回收率、生物素含量相对标准偏差（RSD）。计算结果见下表。
计算后得到回收率在99.0%-100.4%范围内，且平均回收率为99.9%。 以上结果表明，采用HPLC法测定生物素的含量，有较好的准确度，回收率接近百分之百，且在3个浓度水平9次测定的相对标准偏差较小，RSD%仅为0.53%，可满足日常检测需要。
3. 精密度
精密称取生物素样品约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，同法配制得对照品溶液，分别进样测定，记录色谱图，读取主峰面积，用外标法计算生物素含量。连续进样6次，記录色谱图。计算得峰面积RSD为0.39%，计算结果见下表。
以上结果表明，采用HPLC法测定生物素的含量，有较好的精密度。
4. 溶液稳定性试验
精密称取生物素样品约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。分别于室温放置0、4、8、16、24h后进样，记录色谱图，计算峰面积。得生物素峰面积的RSD为0.57%，表明生物素样品溶液在24h内稳定，且没有发现有明显的降解产生。可以在该时间范围内测试样品。
5.专属性试验
取样品溶液和对照品溶液分别按照程序中的测试方法将溶液注入高效液相色谱仪。记录色谱图。比较对照溶液的色谱图和样品溶液的色谱图，对照溶液中获得的色谱图主峰保留时间应与样品溶液中获得的色谱图的保留时间一致，试验证明两者是一致的（见图1、图2），符合要求。从以上试验可以看出样品和标准品主峰保留时间一致可以认为为同一物质，这就是鉴别。
6. 强力破坏试验
将样品置于不同破坏环境下进行破坏试验。检查色谱图变化情况，以观察在可能潜在的破坏条件下，该方法仍旧能有效分离主峰和其他不知名杂质。在氧化剂、还原剂进行破坏的条件下，色谱图和正常色谱条件下几乎没有差别，可以认为样品在氧化剂、还原剂存在条件下该测试方法几乎不受该类破坏条件的影响，能较好分离。在强碱（氢氧化钠溶液）、强酸（稀盐酸）条件下，生物素有一定程度的降解，不过仍能较好分离。在高热环境下生物素有一定的降解，但仍可分离。
五、 样品的测定
精密称取生物素样品（批号：20070826、20070827、20070831）约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。另精密称取生物素对照品约10mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得对照品溶液，分别进样测定，记录色谱图（如图1），用外标法计算生物素含量。计算结果见下表。
六 结论
1. 该方法测定生物素在0.05 mg/ml～0.30mg/ml（相当于工作浓度的25%至工作浓度的150%）浓度范围内有良好的线性关系，生物素样品的线性回归方程为：A=8246.29 C + 15.73，相关系数为0.9999。
2.该方法有良好的精密度，连续进样6次，计算得峰面积RSD为0.39%
3. 溶液室温放置0、4、8、16、24h后测定，峰面积的RSD为0.57%，溶液在24h内稳定，未发现有新的降解产物。
4.采用HPLC法测定本品含量回收率高，平均回收率为99.9%，RSD为0.53%。
5.国外药典采用化学法，本方法采用HPLC法，化学法精密度好，而HPLC法准确度高，尤其是在检测粗品时可选择HPLC法检测生物素的含量。
6.该方法测量生物素含量有比较好的专属性。理论塔板数比较高，并且峰型很好没有拖尾现象产生。
7.该方法的优点：检查速度快。基于验证考虑我们将该方法色谱分析时间执行得比较长，如果单纯出于测量速度的考虑，色谱分析时间大大缩短时间。比较符合生产企业的需要。
8. 该方法在强烈破坏条件下表现了比较好的耐用性。在氧化剂、还原剂存在条件下该测试方法几乎不受该类破坏条件的影响，能较好分离。在强碱（氢氧化钠溶液）、强酸（稀盐酸）条件下，生物素有一定程度的降解，不过仍能较好分离。
参考文献
(1) ICH Q2 Validation of Analysis Procedure.
(2)中国药典2005年版二部附录VD高效液相色谱法.
(3)中国药典2005年版二部附录XIX A 药品质量标准分析方法验证.