探讨同时抑制mTORC1激酶和GSK-3β激酶活性对黑素瘤细胞4EBP1的磷酸化、帽子依赖翻译、细胞存活和凋亡的影响。
方法分别采用二甲基亚砜（DMSO组）、5 nmol/L依维莫司（依维莫司组）、10 μmol/L AR-A014418 (AR-A014418组）、5 nmol/L依维莫司联合10 μmol/L AR-A014418（联合处理组）处理A375细胞，Western印迹法检测4EBP1的磷酸化和生存素蛋白的表达，m7GTP pull-down实验检测eIF4E和eIF4G的相互作用，CCK8法和流式细胞仪分别检测A375细胞的增殖和凋亡。
结果依维莫司和AR-A014418对4EBP1磷酸化和生存素蛋白表达均有一定的抑制作用，两组p4EBP1-65分别为0.74 ± 0.05和0.62 ± 0.06，生存素蛋白分别为0.71 ± 0.06和0.58 ± 0.07，与DMSO组（分别为1.00 ± 0.07和1.00 ± 0.06）相比，均P< 0.001，且联合处理组对4EBP1磷酸化（0.14 ± 0.04）和生存素蛋白表达（0.09 ± 0.05）的抑制更为显著。m7GTP pull-down实验显示，依维莫司组（0.72 ± 0.04）、AR-A014418组（0.67 ± 0.05）、联合处理组（0.12 ± 0.05 ）eIF4G相对值均低于DMSO组（1.00 ± 0.06），而4EBP1相对值均高于DMSO组（分别为1.98 ± 0.16、2.32 ± 0.17、7.58 ± 0.25、1.00 ± 0.08），且联合处理组eIF4G降低和4EBP1增加最为显著。培养24 h时，与DMSO组相比，依维莫司、AR-A014418、依维莫司联合AR-A014418均对A375细胞增殖有抑制作用（后3组抑制率分别为18.5% ± 1.3%、19.8% ± 1.8%、61.2% ± 2.1%），且联合处理组的抑制作用最为显著；培养48 h时，依维莫司和AR-A014418对A375细胞增殖的抑制显示相同的趋势，且其抑制作用随时间的延长而增强。流式细胞仪检测显示，依维莫司和AR-A014418单独处理A375细胞24 h对其凋亡有一定的促进作用（凋亡率分别为14.28% ± 2.18%、14.57% ± 2.35%），联合处理时细胞凋亡更为显著，凋亡率为55.18% ± 6.27%。
结论联合使用依维莫司和AR-A014418显著抑制A375细胞中4EBP1的磷酸化，进而抑制eIF4F蛋白复合物的形成，从而抑制帽子依赖的翻译，促进黑素瘤细胞的凋亡。