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摘 要：采用索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法检测清真牛肉香肠中的苯并（a）芘含量，结果表明，该方法操作简单，检测结果准确，可信度高，回收率可以达到91%以上，特别是对于油脂含量较高的食品具有良好的效果，可以推广到其他肉制品中苯并（a）芘的检测。
关键词：索氏提取；苯并（a）芘；高效液相色谱；固相萃取
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）11-0030-03
烟熏肉制品香肠色泽金黄、风味独特，具有浓郁的烟熏风味，同时具有良好的贮藏性和较长的货架期，但是在肉制品的烟熏过程中，由于烟熏木屑的不完全燃烧或蛋白质和脂肪高温热解会生成多环芳烃类物质，这些物质具有致癌性[1-2]。其中苯并（a）芘是具有代表性的物质，我国对肉制品中苯并（a）芘的限量标准是不超过5?g/kg[3]，
欧盟根据最新修订的标准则是根据苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（β）荧蒽、chrysene四种物质的总量不高于30.0μg/kg（自2012年9月日至2014年8月31日），不高于12.0μg/kg（自2014年9月1日起）[4]。
目前，我国肉制品中苯并（a）芘的检测方法主要有两种，第一是目前的现行国标GB/T5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的测定》[5]，这种方法是试样经过皂化后用有机溶剂提取，在经过液液萃取和柱层析，最后通过荧光分光光度计或目测法进行检测，这是目前最通用的苯并（a）芘检测方法，但是该方法步骤繁琐，而且需要消耗大量的有机溶剂；通过荧光分光光度计或目测法进行检测，检测结果的准确性有待改进；是农业行标NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（a）芘的测定：高效液相色谱法》[6]，这种方法通过多步骤的液液萃取和反萃取收集肉制品中的苯并（a）芘，最后通过高效液相色谱仪进行检测，该方法相对于GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的测定》步骤简单，而且采用高效液相色谱法进行检测，准确度较高，但是由于在液液萃取和反萃取中，会损失一定的液体，同时，如果脂肪含量较高，最终样品中苯并（a）芘的检测结果会有较大的影响。
本实验以烟熏清真牛肉香肠为对象，研究一种新型的肉制品中苯并（a）芘的检测方法，该方法采用索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法进行前处理和检测，步骤简单，检测结果准确，为目前肉制品中苯并（a）芘的检测提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛肉 市售；大豆蛋白、复合磷酸盐、卡拉胶、食盐、蔗糖等辅料购于超市。
正己烷、无水乙醚 国药集团化学试剂北京有限公司；烟熏木屑 北京美添前景科技有限公司；苯并（a）芘标准品 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
Welchom BaP苯并芘专用固相萃取小柱 （22g/60mL）、WelchomC18E固相萃取小柱（200mg/3mL） 上海月旭科技公司；型号高效液相色谱仪-荧光检测器 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 烟熏清真牛肉香肠加工
以牛肉为原料，将其用绞肉机绞碎，通过搅拌机使其与辅料混匀，使用胶原蛋白肠衣灌肠、打结，在烟熏炉中50℃干燥30min，然后烟熏40min，温度50℃。将烟熏后的香肠在90℃蒸煮20min，得到的产品冷却后真空包装，最后进行巴氏杀菌，产品置于冷库中备用。
1.3.2 苯并（a）芘标准曲线的绘制
采用外标法进行定量，配制以甲醇为溶剂质量浓度为150ng/mL的苯并（a）芘标准溶液，然后分别取0、2、4、6、8、10mL质量浓度为150ng/mL的苯并（a）芘标准溶液，定容至10mL，配制成质量浓度分别为0、5、10、15、20ng/mL的标准溶液，再按照上述的色谱条件测定峰面积，以6种标准品的质量浓度为横坐标（x，ng/mL），对应的峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线为y = 83748x+39046（R? = 0.999），说明苯并（a）芘在质量浓度0～25ng/mL的范围内具有良好的线性关系。
1.3.3 色谱条件[6]
色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5?m）；流动相：乙腈-水（体积比88：12）；流速1.2mL/min；荧光检测器：激发波长384nm，发射波长406nm；柱温30℃；进样量10?L。
1.3.4 固相萃取柱的选择
根据苯并（a）芘的极性特点，选用WelchromC18E与Welchrom BaP（氧化铝）2种不同固定相填料对苯并（a）芘进行富集处理，采用空白加标检测苯并（a）芘回收率的方法进行比较。空白中苯并（a）芘质量浓度分别为5ng/mL和20ng/mL。
1.3.5 烟熏清真牛肉香肠中苯并（a）芘的提取
按照国标GB/T 9695.19—2008《肉与肉制品取样方法》[7]取样检测。由于单个产品质量小于500g，因此选取产品5件，在5～10℃的环境中将样品粉碎成肉糜状，混匀。准确称取5g样品，在40℃索氏提取，回流6h，然后将乙醚与脂肪的混合液40℃旋转蒸发浓缩至干，分2次加入10mL的正己烷，转移至15mL的离心管中，漩涡振荡充分混匀，形成样品提取液，备用[8-10]。然后将固相萃取小柱装在固相萃取仪上，加入约30mL正己烷活化，流出液弃用；将之前的样品提取液加入到固相萃取小柱中，然后分4次加入正己烷洗脱，收集洗脱液于茄型瓶中，整个过程在常压下进行，自然洗脱；40℃旋转蒸发浓缩至干，用2mL乙腈定容，过0.45μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法分析[11-13]。
1.3.6 方法的精密度和回收率测定
在已知苯并（a）芘含量的烟熏清真牛肉香肠中分别添加低质量浓度到高质量浓度的苯并（a）芘标准品，进行苯并（a）芘的回收率实验，2个添加水平分别为5ng/mL和20ng/mL，每个添加实验平行测定6次[14]。 2 结果与分析
2.1 苯并（a）芘的标准溶液高效液相色谱色谱图
2.3 固相萃取柱的选择
Welchrom C18E的富集效果为77%以上，也具有较好的富集效果，在多环芳烃类物质的固相萃取富集实验中，Welchrom C18E具有较好的富集效果[15-17]，这也是选其作为对比的原因。Welchrom BaP固相萃取柱对苯并（a）芘具有更高的回收率，可以达到87.6%以上，对苯并（a）芘的富集效果非常显著，可以很好的满足苯并（a）芘检测的要求。Welchrom BaP固相萃取柱主要以氧化铝为固相填料，并进行特殊处理，使其对苯并芘具有非常优秀的富集效果。因此，后续的实验采用Welchrom BaP固相萃取小柱进行样品的富集实验。
2.3 烟熏清真牛肉香肠中苯并（a）芘的检测
Fig.2 HPLC chromatogram of benzo[a]pyrene in sample
对烟熏清真牛肉香肠中的苯并（a）芘含量进行检测，结果如图3所示，可以看出大约10.8min左右有一个明显的吸收峰，与标准曲线对照可确定为苯并（a）芘，由标准曲线可以计算出样品中苯并（a）芘的质量浓度为9.95ng/mL，经过计算可知，烟熏清真牛肉香肠中苯并（a）芘的含量为1.99?g/kg。
2.4 精密度和回收率分析
3 结 论
本实验采用索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法检测烟熏清真牛肉香肠中的苯并（a）芘，该方法操作简单，检测结果准确，可信度高，特别是对于油脂含量较高的食品具有良好的效果[18-20]，由于样品中含有脂肪和瘦肉，而苯并（a）芘易溶于乙醚，因此通过索氏提取同时提取肉制品中的油脂和苯并（a）芘，再通过固相萃取的方式将油脂中的苯并（a）芘提取出来，进行高效液相色谱检测，具有良好的检测效果。
参考文献：
[1] JASNA D， ALEKSANDAR P， WOLGANG J. Polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in different types of smoked meat products from Serbia[J]. Meat Science， 2008， 80（2）： 449-456.
[2] ILZE S V， VADIMS B， AGNESE K， et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons in meat smoked with different types of wood[J]. Food Chemistry， 2008， 110（3）： 794-797.
[3] 刘兴勇， 朱仁俊. 熏烤肉制品风味和有害物质的形成及其防止方法[J]. 食品工业科技， 2010， 31（5）： 405-413
[4] 赵冰， 任琳， 李家鹏， 等. 传统肉制品中多环芳烃来源和检测方法研究进展[J]. 肉类研究， 2012， 26（6）： 50-53.
[5] 中华人民共和国卫生部， 中国国家标准化管理委员会. GB/T 5009.27—2003 食品中苯并（a）芘的测定[S]. 北京： 中国标准出版社， 2003.
[6] 中华人民共和国农业部. NY/T 1666—2008 肉制品中苯并（a）芘的测定 高效液相色谱法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.
[7] 中国商业联合会商业标准中心. GB/T 9695.19—2008 肉与肉制品 取样方法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.
[8] WRETLING S， ERIKSSON A， ESKHULT G A， et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in Swedish smoked meat and fish[J]. Food Composition and Analysis， 2010， 23： 264-272.
[9] WOLFGANG J. A GC/MS method for the determination of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in smoked meat products and liquid smokes[J]. European Food Research and Technology， 2004， 2（18）： 208-212.
[10] SILVAL B O， ADETUNDE O T， OLUSEYI T O， et al. Effects of the methods of smoking on the levels of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in some locally consumed fishes in Nigeria[J]. African Journal of Food Science， 2011， 5（7）： 384-391.
[11] AFSANEH F， JINAP S， FARIDAH A， et al. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in grilled meat[J]. Food Control， 2010， 21： 606-610.
[12] SANTOS C， GOMES A， ROSEIRO L C. Polycyclic aromatic hydrocarbons incidence in Portuguese traditional smoked meat products[J]. Food and Chemical Toxicology， 2011， 49： 2343-2347.
[13] 万红丽， 吉艳峰， 周光宏， 等. 固相萃取技术及其在肉制品中多环芳烃分析的应用[J]. 食品与发酵工业， 2006， 32（12）： 104-107.
[14] 李念念， 周光宏， 徐幸莲. 高效液相色谱荧光法测定腊肉中的苯并芘残留[J]. 食品工业科技， 2013， 34（1）： 319-322.
[15] 潘红. 烤肉中多环芳烃的检测[D]. 无锡： 江南大学， 2009： 9-16
[16] JOSE M L， LAURA P， MARIA C G F， et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in two Spanish traditional smoked sausage varieties： “Androlla” and “Botillo”[J]. Meat Science， 2010， 86（3）： 660-664.
[17] PASCAL M， VERONIQUE P， and ROBAERT J. T. Quantibative determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in barbecued meat sausages by gas chromatography coupled to mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2000， 48（4）： 1160-1166.
[18] 薛鸣， 张虹. 食品中多环芳烃残留分析前处理方法的研究[J]. 食品与发酵工业， 2008， 34（7）： 141-145.
[19] 章汝平， 何立芳. 食品中多环芳烃的提取、纯化、以及检测方法的研究进展[J]. 食品科技， 2007， 32（1）： 20-25.
[20] JOHN W H， THOMAS F. A review of polycyclic aromatic hydrocarbons in foods[J]. Food Chemistry， 1969， 17（3）： 527-531.
关键词：索氏提取；苯并（a）芘；高效液相色谱；固相萃取
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）11-0030-03
烟熏肉制品香肠色泽金黄、风味独特，具有浓郁的烟熏风味，同时具有良好的贮藏性和较长的货架期，但是在肉制品的烟熏过程中，由于烟熏木屑的不完全燃烧或蛋白质和脂肪高温热解会生成多环芳烃类物质，这些物质具有致癌性[1-2]。其中苯并（a）芘是具有代表性的物质，我国对肉制品中苯并（a）芘的限量标准是不超过5?g/kg[3]，
欧盟根据最新修订的标准则是根据苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（β）荧蒽、chrysene四种物质的总量不高于30.0μg/kg（自2012年9月日至2014年8月31日），不高于12.0μg/kg（自2014年9月1日起）[4]。
目前，我国肉制品中苯并（a）芘的检测方法主要有两种，第一是目前的现行国标GB/T5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的测定》[5]，这种方法是试样经过皂化后用有机溶剂提取，在经过液液萃取和柱层析，最后通过荧光分光光度计或目测法进行检测，这是目前最通用的苯并（a）芘检测方法，但是该方法步骤繁琐，而且需要消耗大量的有机溶剂；通过荧光分光光度计或目测法进行检测，检测结果的准确性有待改进；是农业行标NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（a）芘的测定：高效液相色谱法》[6]，这种方法通过多步骤的液液萃取和反萃取收集肉制品中的苯并（a）芘，最后通过高效液相色谱仪进行检测，该方法相对于GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（a）芘的测定》步骤简单，而且采用高效液相色谱法进行检测，准确度较高，但是由于在液液萃取和反萃取中，会损失一定的液体，同时，如果脂肪含量较高，最终样品中苯并（a）芘的检测结果会有较大的影响。
本实验以烟熏清真牛肉香肠为对象，研究一种新型的肉制品中苯并（a）芘的检测方法，该方法采用索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法进行前处理和检测，步骤简单，检测结果准确，为目前肉制品中苯并（a）芘的检测提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛肉 市售；大豆蛋白、复合磷酸盐、卡拉胶、食盐、蔗糖等辅料购于超市。
正己烷、无水乙醚 国药集团化学试剂北京有限公司；烟熏木屑 北京美添前景科技有限公司；苯并（a）芘标准品 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
Welchom BaP苯并芘专用固相萃取小柱 （22g/60mL）、WelchomC18E固相萃取小柱（200mg/3mL） 上海月旭科技公司；型号高效液相色谱仪-荧光检测器 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 烟熏清真牛肉香肠加工
以牛肉为原料，将其用绞肉机绞碎，通过搅拌机使其与辅料混匀，使用胶原蛋白肠衣灌肠、打结，在烟熏炉中50℃干燥30min，然后烟熏40min，温度50℃。将烟熏后的香肠在90℃蒸煮20min，得到的产品冷却后真空包装，最后进行巴氏杀菌，产品置于冷库中备用。
1.3.2 苯并（a）芘标准曲线的绘制
采用外标法进行定量，配制以甲醇为溶剂质量浓度为150ng/mL的苯并（a）芘标准溶液，然后分别取0、2、4、6、8、10mL质量浓度为150ng/mL的苯并（a）芘标准溶液，定容至10mL，配制成质量浓度分别为0、5、10、15、20ng/mL的标准溶液，再按照上述的色谱条件测定峰面积，以6种标准品的质量浓度为横坐标（x，ng/mL），对应的峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线为y = 83748x+39046（R? = 0.999），说明苯并（a）芘在质量浓度0～25ng/mL的范围内具有良好的线性关系。
1.3.3 色谱条件[6]
色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5?m）；流动相：乙腈-水（体积比88：12）；流速1.2mL/min；荧光检测器：激发波长384nm，发射波长406nm；柱温30℃；进样量10?L。
1.3.4 固相萃取柱的选择
根据苯并（a）芘的极性特点，选用WelchromC18E与Welchrom BaP（氧化铝）2种不同固定相填料对苯并（a）芘进行富集处理，采用空白加标检测苯并（a）芘回收率的方法进行比较。空白中苯并（a）芘质量浓度分别为5ng/mL和20ng/mL。
1.3.5 烟熏清真牛肉香肠中苯并（a）芘的提取
按照国标GB/T 9695.19—2008《肉与肉制品取样方法》[7]取样检测。由于单个产品质量小于500g，因此选取产品5件，在5～10℃的环境中将样品粉碎成肉糜状，混匀。准确称取5g样品，在40℃索氏提取，回流6h，然后将乙醚与脂肪的混合液40℃旋转蒸发浓缩至干，分2次加入10mL的正己烷，转移至15mL的离心管中，漩涡振荡充分混匀，形成样品提取液，备用[8-10]。然后将固相萃取小柱装在固相萃取仪上，加入约30mL正己烷活化，流出液弃用；将之前的样品提取液加入到固相萃取小柱中，然后分4次加入正己烷洗脱，收集洗脱液于茄型瓶中，整个过程在常压下进行，自然洗脱；40℃旋转蒸发浓缩至干，用2mL乙腈定容，过0.45μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法分析[11-13]。
1.3.6 方法的精密度和回收率测定
在已知苯并（a）芘含量的烟熏清真牛肉香肠中分别添加低质量浓度到高质量浓度的苯并（a）芘标准品，进行苯并（a）芘的回收率实验，2个添加水平分别为5ng/mL和20ng/mL，每个添加实验平行测定6次[14]。 2 结果与分析
2.1 苯并（a）芘的标准溶液高效液相色谱色谱图
2.3 固相萃取柱的选择
Welchrom C18E的富集效果为77%以上，也具有较好的富集效果，在多环芳烃类物质的固相萃取富集实验中，Welchrom C18E具有较好的富集效果[15-17]，这也是选其作为对比的原因。Welchrom BaP固相萃取柱对苯并（a）芘具有更高的回收率，可以达到87.6%以上，对苯并（a）芘的富集效果非常显著，可以很好的满足苯并（a）芘检测的要求。Welchrom BaP固相萃取柱主要以氧化铝为固相填料，并进行特殊处理，使其对苯并芘具有非常优秀的富集效果。因此，后续的实验采用Welchrom BaP固相萃取小柱进行样品的富集实验。
2.3 烟熏清真牛肉香肠中苯并（a）芘的检测
Fig.2 HPLC chromatogram of benzo[a]pyrene in sample
对烟熏清真牛肉香肠中的苯并（a）芘含量进行检测，结果如图3所示，可以看出大约10.8min左右有一个明显的吸收峰，与标准曲线对照可确定为苯并（a）芘，由标准曲线可以计算出样品中苯并（a）芘的质量浓度为9.95ng/mL，经过计算可知，烟熏清真牛肉香肠中苯并（a）芘的含量为1.99?g/kg。
2.4 精密度和回收率分析
3 结 论
本实验采用索氏提取-固相萃取-高效液相色谱法检测烟熏清真牛肉香肠中的苯并（a）芘，该方法操作简单，检测结果准确，可信度高，特别是对于油脂含量较高的食品具有良好的效果[18-20]，由于样品中含有脂肪和瘦肉，而苯并（a）芘易溶于乙醚，因此通过索氏提取同时提取肉制品中的油脂和苯并（a）芘，再通过固相萃取的方式将油脂中的苯并（a）芘提取出来，进行高效液相色谱检测，具有良好的检测效果。
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