分离、培养并鉴定合成型血管平滑肌细胞 (VSMC),检测靶向标记原肌球蛋白-4 (TPM-4),并采用免疫分子成像技术构建TPM-4抗体靶向型MRI探针,探讨靶向合成型VSMC体外MR成像的可行性。
方法体外分离培养合成型VSMC与内皮细胞 (EC),采用SMA、Ⅷ因子免疫细胞化学染色方法分别行细胞鉴定;免疫荧光双重染色验证合成型VSMC高表达TPM-4蛋白;应用化学交联法合成靶向TPM-4MRI分子探针,TPM-4标记探针 (TPM4-USPIO) 为实验探针组、IgG标记探针 (IgG-USPIO) 为阴性探针组、未标记探针 (USPIO) 为对照探针组,PBS为空白组,实验组探针分别与合成型VSMC及EC共孵育,阴性组、对照组探针与VSMCEC共孵育。采用普鲁士蓝染色分析探针特异靶向性,噻唑蓝 (MTT) 比色法分析不同铁浓度条件下 (含铁浓度梯度分别为0、5、10、20、40μg/ml) 对细胞体外生物学活性的影响;采用7.0TMR扫描仪检测探针磁学特性,并对不同探针组标记的合成型VSMC (n=3) 以及1×103、5×103、1×104、5×104、1×105个/管 (n=3) 不同浓度梯度TPM4-USPIO标记细胞行体外细胞T2WI成像分析。T2信号数据以及MTT结果数据组间比较先行单因素方差分析 (ANOVA),若差异有统计学意义,再用LSD法行组间两两比较。
结果成功分离并培养了合成型VSMC,合成型VSMC中TPM-4呈高表达;成功构建TPM-4、IgG抗体标记靶向型探针,TPM4-USPIO、IgG-USPIO探针弛豫率分别为0.0350×106、0.0316×106mol/s,同USPIO (0.0292×106mol/s) 磁学特性相似,稳定性高;普鲁士蓝染色结果显示实验组探针与合成型VSMC呈特异性结合,与EC无特异性结合,MTT结果表明铁浓度≤40μg/ml范围内对合成型VSMC增殖活性无影响;实验探针组标记细胞T2WI呈低信号,较阴性探针组、对照探针组及空白组信号变化明显,T2弛豫时间为 (116.67±2.08) ms,明显短于以上3组探针[ (217.67±2.52) 、 (219.33±2.08) 及 (205.33±1.53) ms],差异具有统计学意义 (F=1670.43,P<0.01) ;1×103、1×104、1×1053种浓度细胞之间T2弛豫时间分别为 (184.33±2.08) 、 (169.67±1.15) 、 (116.67±2.08) ms,差异具有统计学意义 (F=684.35,P<0.01),T2WI信号梯度减低,同一数量级细胞之间T2值变化差异无统计学意义 (P值均>0.05) 。
结论血小板衍化生长因子 (PDGF) -BB处理后可获得合成型VSMC,TPM4-USPIO探针能够高效、靶向性结合合成型VSMC,高场强MRIT2WI信号变化显著,为血管性疾病在体靶向合成型VSMC的相关分子影像学研究提供了新的切入点。