【摘 要】
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目的探讨anti-PD-1(scFv)/hIL-15(简称PD-15)融合蛋白体外特异性结合PD-1的能力及联合GF-hIL-15Ra-K562(简称G15Ra-K562)滋养细胞对自然杀伤细胞(NK)/T细胞增殖能力的影响。方法Overlap PCR构建G15Ra表达载体，电穿孔仪转染K562，极限稀释法获取G15Ra-K562滋养细胞单克隆株。酶切连接构建PD-15表达载体，Lipofecta
【机 构】
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郑州大学附属肿瘤医院免疫治疗科 450008,郑州大学附属肿瘤医院免疫治疗科 450008,郑州大学附属肿瘤医院免疫治疗科 450008,郑州大学附属肿瘤医院免疫治疗科 450008,郑州大学附属肿瘤
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目的探讨anti-PD-1(scFv)/hIL-15(简称PD-15)融合蛋白体外特异性结合PD-1的能力及联合GF-hIL-15Ra-K562(简称G15Ra-K562)滋养细胞对自然杀伤细胞(NK)/T细胞增殖能力的影响。
方法Overlap PCR构建G15Ra表达载体，电穿孔仪转染K562，极限稀释法获取G15Ra-K562滋养细胞单克隆株。酶切连接构建PD-15表达载体，Lipofectamine™ 2000瞬时转染HEK293T细胞并获取包含PD-15融合蛋白的条件培养液。密度梯度离心获取人外周血单个核细胞，CFSE染色标记活跃增殖细胞。流式细胞术检测PD-15特异性结合PD-1的能力和对人外周血单个核细胞的增殖及不同淋巴亚群比例的影响。
结果成功构建高表达融合蛋白G15Ra的滋养细胞单克隆株G15Ra-K562。添加hIL-15能够将G15Ra-K562滋养细胞扩增人外周血淋巴细胞能力提升5倍以上(P<0.05)。PD-15融合蛋白具有PD-1特异性结合能力(P<0.001)，联合G15Ra-K562滋养细胞能够在体外高效扩增人外周血来源的NK/T细胞(P<0.05)，扩增得到的细胞产品中以NK、CD8+T和CD4+T细胞为主。
结论PD-15融合蛋白能够特异性靶向PD-1分子且在联合G15Ra-K562滋养细胞后具有强的人外周血来源的NK/T细胞扩增能力，建立了分步、靶向递送IL-15/IL-15Ra复合物至PD-1+细胞的细胞培养方案，为后续选择性扩增PD-1+细胞提供实验资料。
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