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摘要：为了深入研究百合响应高温胁迫的分子机制，本研究以麝香百合杂种系品种白天堂为试验材料，从中分离得到1个MBFle基因，其开放阅读框为438bp，编码145个氨基酸，蛋白质分子量为15900，理论等电点为10.22。多序列同源比对和进化树分析表明百合MBFle具有典型的MBF1和HTH结构域，归属c亚型MBF1，因此将克隆到的基因命名为LIMBFle。亚细胞定位结果表明，LIMBFle可能介导了热激信号由细胞质向细胞核的转导。实时荧光定量PCR分析结果表明，LIMBFle在叶中的表达量最高，根中次之，鳞茎中最低;LIMBFle的表达受热激诱导。表明，LIMBFle基因可能与百合的热激反应密切相关。
关键词：百合;MBF1;基因克隆;亚细胞定位;表达分析
中图分类号：Q785
文献标识码： A
文章编号： 1000-4440（2018） 05-1120-08
百合（Lilium spp.）为百合科百合属球根花卉，具有重要的观赏、食用和药用价值。百合性喜冷凉、湿润气候，耐热性较差，然而中国大部分地区夏季炎热，高温造成百合生长停滞、植株矮小、少花盲花、茎秆软、病虫害严重等现象，严重影响切花的产量和质量，并造成种球退化，制约着中国百合商品化周年生產。所以，提高百合耐热性是解决这一问题的关键。在百合野生种中，麝香百合（Lilium longiflorumThunb）和台湾百合（Lilium formosanum Wallace）的耐热性较强，它们的杂交品种也具有较强的耐热性。因此，解析耐热百合品种的高温逆境响应机制，鉴定调控耐热性的关键基因，对于采用基因工程技术来提高百合的耐热性具有重要的理论和实践意义。
目前的研究结果表明，植物响应高温胁迫的调控途径主要有：热激转录因子一热激蛋白（HSF-HSP）途径、钙离子一钙调蛋白（Ca2 _CaM）途径、活性氧（ROS）途径、激素调控途径、细胞未折叠蛋白响应（UPR）途径和核小体介导途径。细胞内的这些调控途径相互交叉组成了植物的热激信号转导网络。近年来，植物多蛋白桥梁因子（Multiprotein bridgingfactor lc.MBFlc）被鉴定为调控植物耐热性的重要转录调节因子。MBFlc又称转录辅激活因子（Tran-scriptional Co-activator），可以连接通用转录因子TBP（TATA-box Binding Protein）和基因特异性转录因子，从而增强特异性转录因子的DNA结合活性，最终促进靶基因的表达。研究发现，MBFlc涉及通过激素、HSF-HSP、ROS和Ca2 信号途径调控植物的耐热性，是植物热激信号转导网络的关键节点。
本研究以耐热性较好的麝香百合杂种系品种白天堂（L.lon，giflorum cv.White Heaven）为试验材料，从中克隆了MBFlc基因，分析百合MBFlc蛋白特性及MBFlc基因在热胁迫下的表达模式，以期为进一步研究MBFlc基因在百合耐热性调节方面的功能及作用机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为麝香百合杂种系品种白天堂组培苗，培养条件为22℃，光照时间为16h/d。亚细胞定位使用的材料为紫皮洋葱（Allium cepa）。
RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态DH5a购自北京天根生化科技有限公司，DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司.5’-Full RACE kit、pMD18-T载体、M-MLV逆转录试剂盒、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶等购自TaKaRa公司，荧光定量试剂盒SYBRFAST qPCR Universal Kit购自KAPA公司，氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）购自Sigma公司，其他常规试剂均为进口或国产分析纯。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（试验所用引物见表1）;DNA测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 LIMBFlc全长cDNA克隆 用37℃热激处理百合组培苗2h，然后取0.1g叶片用液氮研磨提取RNA。RNA的提取根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行。用NanoDrop 2000 Spectro-photometer（Thermo，USA）检测吸光值（A260/A 230和A260/A280）判断RNA的质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成根据TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）说明书进行，反转录接头引物为AP。
基因保守片段的克隆：根据GenBank数据库中报道的其他植物MBFlc mRNA序列，通过DNAman5软件进行同源比对，设计保守区兼并引物。以反转录的cDNA为模板，利用巢式PCR扩增中间保守片段，第一轮引物为DPF1（上游）和DPR1（下游），反应程序为：94℃5 min;94℃30s，57℃ 30 s，72℃40s，33个循环;72℃10 min。取1μ1产物作第二轮反应的模板，第二轮引物为DPF2（上游）和DPR2（下游），反应程序为：94℃5 min;94℃30s.58℃30 s.72℃ 30 s，33个循环;72℃10 min。
基因3’端序列的克隆：通过RACE（Rapid Am-plification of cDNA Ends）的方法获得目的基因的3’端序列。以cDNA为模板，根据已经克隆的目的基因保守片段设计2条上游特异引物，分别与下游的3’接头引物进行PCR扩增。第一轮引物为SPF1和AP1，反应程序为：94℃5 min;94 0C 30 s.63℃30s，72℃1
关键词：百合;MBF1;基因克隆;亚细胞定位;表达分析
中图分类号：Q785
文献标识码： A
文章编号： 1000-4440（2018） 05-1120-08
百合（Lilium spp.）为百合科百合属球根花卉，具有重要的观赏、食用和药用价值。百合性喜冷凉、湿润气候，耐热性较差，然而中国大部分地区夏季炎热，高温造成百合生长停滞、植株矮小、少花盲花、茎秆软、病虫害严重等现象，严重影响切花的产量和质量，并造成种球退化，制约着中国百合商品化周年生產。所以，提高百合耐热性是解决这一问题的关键。在百合野生种中，麝香百合（Lilium longiflorumThunb）和台湾百合（Lilium formosanum Wallace）的耐热性较强，它们的杂交品种也具有较强的耐热性。因此，解析耐热百合品种的高温逆境响应机制，鉴定调控耐热性的关键基因，对于采用基因工程技术来提高百合的耐热性具有重要的理论和实践意义。
目前的研究结果表明，植物响应高温胁迫的调控途径主要有：热激转录因子一热激蛋白（HSF-HSP）途径、钙离子一钙调蛋白（Ca2 _CaM）途径、活性氧（ROS）途径、激素调控途径、细胞未折叠蛋白响应（UPR）途径和核小体介导途径。细胞内的这些调控途径相互交叉组成了植物的热激信号转导网络。近年来，植物多蛋白桥梁因子（Multiprotein bridgingfactor lc.MBFlc）被鉴定为调控植物耐热性的重要转录调节因子。MBFlc又称转录辅激活因子（Tran-scriptional Co-activator），可以连接通用转录因子TBP（TATA-box Binding Protein）和基因特异性转录因子，从而增强特异性转录因子的DNA结合活性，最终促进靶基因的表达。研究发现，MBFlc涉及通过激素、HSF-HSP、ROS和Ca2 信号途径调控植物的耐热性，是植物热激信号转导网络的关键节点。
本研究以耐热性较好的麝香百合杂种系品种白天堂（L.lon，giflorum cv.White Heaven）为试验材料，从中克隆了MBFlc基因，分析百合MBFlc蛋白特性及MBFlc基因在热胁迫下的表达模式，以期为进一步研究MBFlc基因在百合耐热性调节方面的功能及作用机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为麝香百合杂种系品种白天堂组培苗，培养条件为22℃，光照时间为16h/d。亚细胞定位使用的材料为紫皮洋葱（Allium cepa）。
RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态DH5a购自北京天根生化科技有限公司，DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司.5’-Full RACE kit、pMD18-T载体、M-MLV逆转录试剂盒、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶等购自TaKaRa公司，荧光定量试剂盒SYBRFAST qPCR Universal Kit购自KAPA公司，氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）购自Sigma公司，其他常规试剂均为进口或国产分析纯。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（试验所用引物见表1）;DNA测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 LIMBFlc全长cDNA克隆 用37℃热激处理百合组培苗2h，然后取0.1g叶片用液氮研磨提取RNA。RNA的提取根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行。用NanoDrop 2000 Spectro-photometer（Thermo，USA）检测吸光值（A260/A 230和A260/A280）判断RNA的质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成根据TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）说明书进行，反转录接头引物为AP。
基因保守片段的克隆：根据GenBank数据库中报道的其他植物MBFlc mRNA序列，通过DNAman5软件进行同源比对，设计保守区兼并引物。以反转录的cDNA为模板，利用巢式PCR扩增中间保守片段，第一轮引物为DPF1（上游）和DPR1（下游），反应程序为：94℃5 min;94℃30s，57℃ 30 s，72℃40s，33个循环;72℃10 min。取1μ1产物作第二轮反应的模板，第二轮引物为DPF2（上游）和DPR2（下游），反应程序为：94℃5 min;94℃30s.58℃30 s.72℃ 30 s，33个循环;72℃10 min。
基因3’端序列的克隆：通过RACE（Rapid Am-plification of cDNA Ends）的方法获得目的基因的3’端序列。以cDNA为模板，根据已经克隆的目的基因保守片段设计2条上游特异引物，分别与下游的3’接头引物进行PCR扩增。第一轮引物为SPF1和AP1，反应程序为：94℃5 min;94 0C 30 s.63℃30s，72℃1