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【摘要】建立了一种以中空纤维为支持膜的三相液相微萃取（HF-LPME）进行前处理，用高效液相色谱检测吸毒嫌疑人尿液中吗啡的方法。研究表明该方法集萃取和浓缩一步完成，简单，快速，消耗有机溶剂少，方法学评价表明线性范围为0.1~1.0µg/mL（r=0. 9981），相对标准偏差在1.3%~5.2%，检测限为56ng/mL，回收率为42%以上，富集倍数为113。
【关键词】法医毒物分析；吗啡；中空纤维液相微萃取；高效液相色谱；尿液
吗啡（morphine），从罂粟植物中提取的有效成分，是鸦片中最主要的生物碱，也是镇痛效果最好、毒性最强的生物碱。在医疗上作为麻醉药品广泛使用，也是我国国家严格管制的传统毒品，同时，吗啡也是海洛因毒品的主要代谢产物，是验证嫌疑人是否吸食注射海洛因的证据。吗啡因具有氨基结构与酚羟基结构，因而显两性，兼之极性较大，采用气相色谱分析需要进行衍生化[
]。对于生物检材中吗啡的前处理，通常采用液相萃取法、需使用大量有机溶剂，萃取率偏低。液相微萃取技术应用溶剂量少，富集效果较好，环保绿色，近年来不断得到应用[2]。中空纤维液相微萃取技术（HF-LPME），是以多孔中空纤维膜作为微萃取溶剂的载体，样品溶液与在中空纤维腔中的有机溶剂进行萃取，生物检材大分子则不能通过纤维壁。该方法集采样、萃取和浓缩于一体[3]，可用于复杂基质样品的直接分析，已初步应用于环境分析与药物分析领域[4-5]。本文采用空纤维膜液相微萃取-高效液相色谱联用测定尿中的吗啡，并进行方法学考察，可用于鉴定吸毒嫌疑人是否吸食、注射海洛因或吗啡毒品。
1 材料与方法
1.1材料
主要材料、试剂与仪器
日本日立高效液相色谱仪(HITACHI D-7000；检测器：UV L-7420)，HSM色谱工作站，色谱柱phenomenex C18反相色谱柱（250×4.6mm，pH范围2-10），DF 101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂）, Accurel Q3/2 聚丙烯中空纤维(Membrana,Wupperta,Germany,壁厚 200μm,孔径 0.2μm,内径 600μm，PHS-25 型 pH 计。Accurel Q3/2聚丙烯中空纤维（壁厚200μm，孔径0.2μm，内径600μm）；吗啡标准品（购于公安部物证鉴定中心）。磷酸、磷酸二氢钾、三乙胺、甲苯、邻二甲苯、环己酮、正壬醇、乙酸丁酯、乙酸辛酯、正辛醇和苯均为分析纯;实验用水为娃哈哈纯净水。甲醇、乙腈均为色谱纯。
试剂配置
标准储备溶液(1.0mg/mL):用电子天平精密称取盐酸吗啡1.13mg分别溶于lmL甲醇溶液中,配成1.0mg/mL的甲醇储备液。
实际样品：海洛因吸毒人尿液(沈阳市公安局禁毒支队)及正常人空白尿置于冰箱中保存,保存时间不超过48小时。
1.2 中空纤维液相微萃取
取空白尿液10mL，用 1.0mol/mL 的H3PO4溶液调节至pH=9,加入混合标准工作液，使目标物浓度调为1.0μg/mL,样品相体积为10mL，在样品瓶中加入微型磁力搅拌子,将样品瓶密封。剪取5cm聚丙烯中空纤维，将其浸没到辛醇溶剂中1min，取出，迅速用气相色谱专用微量注射器吸取20uL接收相注入中空纤维内腔中，两端用5mL一次性注射针头固定，形成U型模式，插入样品溶液中，将样品瓶瓶盖密封，放入恒温磁力搅拌器中，调节温度为40°C，转数为900r/min，萃取40min，停止搅拌，用微量注射器抽回内腔中水相，直接注入到高效液相色谱中检验。萃取示意图见图1。
图1 中空纤维液相微萃取模式示意图
1.3高效液相色谱条件
流动相条件:流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾+0.02m01/L三乙胺水溶液,用磷酸调pH=6.O；流动相B:乙腈，A、B均脱气备用。流动相分配为A:B=90:10。流动相流速为1.OmL/min，色谱检测波长为211nm，进样量为10uL。
2 结果与讨论
2.1 中空纤维液相微萃取基本原理
中空纤维三相微萃取体系包括三相：样品相、有机相（中空纤维内膜）、接收相，将有机溶剂吸附进入到中空纤维内膜中，将接受相（水相）注入中空纤维内腔内。样品相中的分析物最初被萃取到有机相中,然后被反萃到接受相。在本研究中,吗啡以盐酸盐的形式存在于样品相中,萃取前用0.1mol/L氢氧化钠调节样品相的pH值至9.0，使盐酸吗啡中性化以降低其在样品相中的溶解度, 通过搅拌，被萃取到有机相中，由于接受相的强酸性(pH=2),吗啡在有机相与接受相界面上与接受相中的酸中和成盐, 从而被反萃进接受相。接受相可以直接进样到毛细管电泳或高效液相色谱体系中进行分析。由于液-液-液三相微萃取一般具有较高的样品相与接受相之间的体积比。因此将获得较高的萃取效率。
2.2中空纤维液相微萃取条件的优化
2.2.1萃取溶剂选择
选择合适的萃取溶剂是提高HF-LPME效率的关键，理想的萃取溶剂应符合：①对目标物有高选择性和较强的萃取富集能力；②挥发性小且在样品溶液中溶解度低或不溶，以减少萃取中溶剂的损失；③与中空纤维亲和力好，易于在较短的时间内固定于纤维膜孔中；④易与分析物分离，有很好的色谱行为，对目标物的后续仪器分析不产生干扰；⑤毒性小、对环境危害小。
本实验选用甲苯、乙酸乙酯、乙酸辛酯、正壬醇和正辛醇5种有机溶剂，在空白尿样中加入5µg/mL吗啡标准溶液按本文方法进行萃取。结果表明，辛醇的萃取效果最好（图2）。
图2 不同溶剂对萃取效率的影响
2.2.2样品接收相及最佳酸度的选择
由于样品接收相须为酸性介质，才能与内膜中的分析物形成离子化状态被反萃到接收相（水相）中。可应用的酸有盐酸、磷酸、醋酸、甲酸等。由于盐酸中含有大量氯离子（Cl-），对高效液相色谱的色谱柱损伤较大，尽量选取其他酸体系。醋酸体系，其电离度为其中pH在1-2期间时，基本不电离，其浓酸酸pH=2左右，但醋酸易挥发，酸味明显，对实验操作者危害大。磷酸体系则不受以上因素的影响。因此选择磷酸为样品接收相。
在三相体系中，样品相和接收相的pH值共同影响萃取结果，调节样品相pH值使目标分析物呈去离子状态,提高有机溶剂对分析物的萃取能力，调节接收相pH值使分析物呈离子状态提高接收相对分析物的反萃取能力 [6]。
吗啡为两性物质，当样品相为9时呈去离子状态，有机溶剂对其萃取率最高，无需再考察。重点考察样品相的pH值对其影响。本文在空白尿样中加入1µg/mL吗啡标准溶液按本文方法进行萃取，考察样品溶液pH值为1-3时的萃取效率。结果显示，当pH 1时，吗啡富集倍数最高，
2.2.3 搅拌速度选择
搅拌可破坏样本溶液与有机液滴之间的扩散层厚度，增加分析物在液相中的扩散系数，同时可增加有机液膜的震动，提高分析物向溶剂的扩散速率，缩短达到平衡的时间[8]。本实验对1µg/mL吗啡空白添加尿样进行萃取，考察搅拌速率为400~1200r/min时的萃取效果。结果显示，最佳搅拌速率为1000r/min（图3）。
图3 搅拌速度对萃取效率的影响
2.2.4 萃取时间选择
分析物的萃取量随萃取时间增加而逐渐增至最大，如将分配平衡时作为萃取终点将导致萃取时间过长，考虑到萃取剂本身的溶解损失，可能使最大萃取量下降[9]。本实验对1µg/mL吗啡空白添加尿样进行萃取，考察萃取时间为10~60min时吗啡的萃取效率。结果显示，萃取时间为40min时效率最好。
2.2.5优化条件下吗啡色谱分析结果
分别向空白尿液中添加5μg吗啡、乙基吗啡（作为内标物）标准溶液，按以上选择的最佳实验条件进行萃取，进行高效液相色谱检测，得到吗啡液相色谱图。（图4）。
图4 空白尿添加1-1µg吗啡（3.27min）、2-1µg乙基吗啡（4.79min）液相色谱图
2.3方法学评价
2.3.1线性方程
取10mL空白尿中分别加入1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100µg吗啡标准储备溶液在优化萃取条件下，以外标法进行定量分析。以吗啡色谱峰面积纵坐标（y），浓度为横坐标（x，µg/mL），在0.10~10.0µg/mL浓度范围内，吗啡的标准曲线为y=48.69x+16.27，相关系数r=0.9981。
2.3.2 萃取回收率及富集倍数
根据中空纤维三相萃取原理，富集倍数为萃取后的有机溶剂中目标物的浓度与萃取前样品中目标物浓度的比值。
萃取回收率为。
上式中ns，initial和na，final分别代表样品相和萃取后接受相中目标分析物的摩尔量，Va为接收相的体积，Vs为样品相体积，Ca.final和Cs,initial分别为接收有机相中和样品中分析物的浓度。
向空白尿液中添加吗啡标准溶液，用缓冲溶液定容至10mL。按本文优化实验方法操作，计算其萃取回收率及富集倍数，其中VS按照10mL,Va为5cm（中空纤维长度）×2.6µＬ(每1cm中空纤维内腔体积)=13 µＬ计算。结果为吗啡富集倍数为113，当添加的吗啡浓度为0.05µg/mL时，回收率为42%，当吗啡浓度为0.1µg/mL，回收率为55%。
2.3.3 检出限及精密度
按照本文优化萃取条件，分别对吗啡浓度为0.1、1.0、10.0µg/mL的添加尿样平行萃取6次，相对标准偏差（RSD）分别为5.2%、13.6%和1.3%。结果表明，本文方法重现性好，受基质干扰小。以信噪比S /N=3计算，吗啡的最低检出限为56ng/mL，可以满足实际检案的要求。
参考文献
[1] 罗芳，罗璇，微波衍生化和GC/MS/MS技术分析血、尿中的吗啡[J].刑事技术，2011（4），
21-23
[2]黄星，马果花，王芳琳，等.液相微萃取技术及其在毒物分析中的应用[J].分析测试学报，2008，27（3）.
[3]Pedenson-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-liquid-liquid microextraction for sample preparation of biological fluids prior to capillary eletrophoresis[J]. Analytical Chemistry, 1999, 71:2650-2656．
[4]邵焰，张丽君，张占恩.中空纤维膜-液相微萃取-气相色谱/质谱法测定土壤中拟除虫菊酯类农
药[J].分析化学，2011，39（11）：1753-1757.
[5] 赵汝松，徐晓白，刘秀芬. 液相微萃取技术的研究进展[J]. 分析化学，2004，32（9）：1246-1251.
【基金项目】大学生创新训练项目“中空纤维液相微萃取检测生物检材中的吗啡（201210175027）”
【关键词】法医毒物分析；吗啡；中空纤维液相微萃取；高效液相色谱；尿液
吗啡（morphine），从罂粟植物中提取的有效成分，是鸦片中最主要的生物碱，也是镇痛效果最好、毒性最强的生物碱。在医疗上作为麻醉药品广泛使用，也是我国国家严格管制的传统毒品，同时，吗啡也是海洛因毒品的主要代谢产物，是验证嫌疑人是否吸食注射海洛因的证据。吗啡因具有氨基结构与酚羟基结构，因而显两性，兼之极性较大，采用气相色谱分析需要进行衍生化[
]。对于生物检材中吗啡的前处理，通常采用液相萃取法、需使用大量有机溶剂，萃取率偏低。液相微萃取技术应用溶剂量少，富集效果较好，环保绿色，近年来不断得到应用[2]。中空纤维液相微萃取技术（HF-LPME），是以多孔中空纤维膜作为微萃取溶剂的载体，样品溶液与在中空纤维腔中的有机溶剂进行萃取，生物检材大分子则不能通过纤维壁。该方法集采样、萃取和浓缩于一体[3]，可用于复杂基质样品的直接分析，已初步应用于环境分析与药物分析领域[4-5]。本文采用空纤维膜液相微萃取-高效液相色谱联用测定尿中的吗啡，并进行方法学考察，可用于鉴定吸毒嫌疑人是否吸食、注射海洛因或吗啡毒品。
1 材料与方法
1.1材料
主要材料、试剂与仪器
日本日立高效液相色谱仪(HITACHI D-7000；检测器：UV L-7420)，HSM色谱工作站，色谱柱phenomenex C18反相色谱柱（250×4.6mm，pH范围2-10），DF 101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂）, Accurel Q3/2 聚丙烯中空纤维(Membrana,Wupperta,Germany,壁厚 200μm,孔径 0.2μm,内径 600μm，PHS-25 型 pH 计。Accurel Q3/2聚丙烯中空纤维（壁厚200μm，孔径0.2μm，内径600μm）；吗啡标准品（购于公安部物证鉴定中心）。磷酸、磷酸二氢钾、三乙胺、甲苯、邻二甲苯、环己酮、正壬醇、乙酸丁酯、乙酸辛酯、正辛醇和苯均为分析纯;实验用水为娃哈哈纯净水。甲醇、乙腈均为色谱纯。
试剂配置
标准储备溶液(1.0mg/mL):用电子天平精密称取盐酸吗啡1.13mg分别溶于lmL甲醇溶液中,配成1.0mg/mL的甲醇储备液。
实际样品：海洛因吸毒人尿液(沈阳市公安局禁毒支队)及正常人空白尿置于冰箱中保存,保存时间不超过48小时。
1.2 中空纤维液相微萃取
取空白尿液10mL，用 1.0mol/mL 的H3PO4溶液调节至pH=9,加入混合标准工作液，使目标物浓度调为1.0μg/mL,样品相体积为10mL，在样品瓶中加入微型磁力搅拌子,将样品瓶密封。剪取5cm聚丙烯中空纤维，将其浸没到辛醇溶剂中1min，取出，迅速用气相色谱专用微量注射器吸取20uL接收相注入中空纤维内腔中，两端用5mL一次性注射针头固定，形成U型模式，插入样品溶液中，将样品瓶瓶盖密封，放入恒温磁力搅拌器中，调节温度为40°C，转数为900r/min，萃取40min，停止搅拌，用微量注射器抽回内腔中水相，直接注入到高效液相色谱中检验。萃取示意图见图1。
图1 中空纤维液相微萃取模式示意图
1.3高效液相色谱条件
流动相条件:流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾+0.02m01/L三乙胺水溶液,用磷酸调pH=6.O；流动相B:乙腈，A、B均脱气备用。流动相分配为A:B=90:10。流动相流速为1.OmL/min，色谱检测波长为211nm，进样量为10uL。
2 结果与讨论
2.1 中空纤维液相微萃取基本原理
中空纤维三相微萃取体系包括三相：样品相、有机相（中空纤维内膜）、接收相，将有机溶剂吸附进入到中空纤维内膜中，将接受相（水相）注入中空纤维内腔内。样品相中的分析物最初被萃取到有机相中,然后被反萃到接受相。在本研究中,吗啡以盐酸盐的形式存在于样品相中,萃取前用0.1mol/L氢氧化钠调节样品相的pH值至9.0，使盐酸吗啡中性化以降低其在样品相中的溶解度, 通过搅拌，被萃取到有机相中，由于接受相的强酸性(pH=2),吗啡在有机相与接受相界面上与接受相中的酸中和成盐, 从而被反萃进接受相。接受相可以直接进样到毛细管电泳或高效液相色谱体系中进行分析。由于液-液-液三相微萃取一般具有较高的样品相与接受相之间的体积比。因此将获得较高的萃取效率。
2.2中空纤维液相微萃取条件的优化
2.2.1萃取溶剂选择
选择合适的萃取溶剂是提高HF-LPME效率的关键，理想的萃取溶剂应符合：①对目标物有高选择性和较强的萃取富集能力；②挥发性小且在样品溶液中溶解度低或不溶，以减少萃取中溶剂的损失；③与中空纤维亲和力好，易于在较短的时间内固定于纤维膜孔中；④易与分析物分离，有很好的色谱行为，对目标物的后续仪器分析不产生干扰；⑤毒性小、对环境危害小。
本实验选用甲苯、乙酸乙酯、乙酸辛酯、正壬醇和正辛醇5种有机溶剂，在空白尿样中加入5µg/mL吗啡标准溶液按本文方法进行萃取。结果表明，辛醇的萃取效果最好（图2）。
图2 不同溶剂对萃取效率的影响
2.2.2样品接收相及最佳酸度的选择
由于样品接收相须为酸性介质，才能与内膜中的分析物形成离子化状态被反萃到接收相（水相）中。可应用的酸有盐酸、磷酸、醋酸、甲酸等。由于盐酸中含有大量氯离子（Cl-），对高效液相色谱的色谱柱损伤较大，尽量选取其他酸体系。醋酸体系，其电离度为其中pH在1-2期间时，基本不电离，其浓酸酸pH=2左右，但醋酸易挥发，酸味明显，对实验操作者危害大。磷酸体系则不受以上因素的影响。因此选择磷酸为样品接收相。
在三相体系中，样品相和接收相的pH值共同影响萃取结果，调节样品相pH值使目标分析物呈去离子状态,提高有机溶剂对分析物的萃取能力，调节接收相pH值使分析物呈离子状态提高接收相对分析物的反萃取能力 [6]。
吗啡为两性物质，当样品相为9时呈去离子状态，有机溶剂对其萃取率最高，无需再考察。重点考察样品相的pH值对其影响。本文在空白尿样中加入1µg/mL吗啡标准溶液按本文方法进行萃取，考察样品溶液pH值为1-3时的萃取效率。结果显示，当pH 1时，吗啡富集倍数最高，
2.2.3 搅拌速度选择
搅拌可破坏样本溶液与有机液滴之间的扩散层厚度，增加分析物在液相中的扩散系数，同时可增加有机液膜的震动，提高分析物向溶剂的扩散速率，缩短达到平衡的时间[8]。本实验对1µg/mL吗啡空白添加尿样进行萃取，考察搅拌速率为400~1200r/min时的萃取效果。结果显示，最佳搅拌速率为1000r/min（图3）。
图3 搅拌速度对萃取效率的影响
2.2.4 萃取时间选择
分析物的萃取量随萃取时间增加而逐渐增至最大，如将分配平衡时作为萃取终点将导致萃取时间过长，考虑到萃取剂本身的溶解损失，可能使最大萃取量下降[9]。本实验对1µg/mL吗啡空白添加尿样进行萃取，考察萃取时间为10~60min时吗啡的萃取效率。结果显示，萃取时间为40min时效率最好。
2.2.5优化条件下吗啡色谱分析结果
分别向空白尿液中添加5μg吗啡、乙基吗啡（作为内标物）标准溶液，按以上选择的最佳实验条件进行萃取，进行高效液相色谱检测，得到吗啡液相色谱图。（图4）。
图4 空白尿添加1-1µg吗啡（3.27min）、2-1µg乙基吗啡（4.79min）液相色谱图
2.3方法学评价
2.3.1线性方程
取10mL空白尿中分别加入1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100µg吗啡标准储备溶液在优化萃取条件下，以外标法进行定量分析。以吗啡色谱峰面积纵坐标（y），浓度为横坐标（x，µg/mL），在0.10~10.0µg/mL浓度范围内，吗啡的标准曲线为y=48.69x+16.27，相关系数r=0.9981。
2.3.2 萃取回收率及富集倍数
根据中空纤维三相萃取原理，富集倍数为萃取后的有机溶剂中目标物的浓度与萃取前样品中目标物浓度的比值。
萃取回收率为。
上式中ns，initial和na，final分别代表样品相和萃取后接受相中目标分析物的摩尔量，Va为接收相的体积，Vs为样品相体积，Ca.final和Cs,initial分别为接收有机相中和样品中分析物的浓度。
向空白尿液中添加吗啡标准溶液，用缓冲溶液定容至10mL。按本文优化实验方法操作，计算其萃取回收率及富集倍数，其中VS按照10mL,Va为5cm（中空纤维长度）×2.6µＬ(每1cm中空纤维内腔体积)=13 µＬ计算。结果为吗啡富集倍数为113，当添加的吗啡浓度为0.05µg/mL时，回收率为42%，当吗啡浓度为0.1µg/mL，回收率为55%。
2.3.3 检出限及精密度
按照本文优化萃取条件，分别对吗啡浓度为0.1、1.0、10.0µg/mL的添加尿样平行萃取6次，相对标准偏差（RSD）分别为5.2%、13.6%和1.3%。结果表明，本文方法重现性好，受基质干扰小。以信噪比S /N=3计算，吗啡的最低检出限为56ng/mL，可以满足实际检案的要求。
参考文献
[1] 罗芳，罗璇，微波衍生化和GC/MS/MS技术分析血、尿中的吗啡[J].刑事技术，2011（4），
21-23
[2]黄星，马果花，王芳琳，等.液相微萃取技术及其在毒物分析中的应用[J].分析测试学报，2008，27（3）.
[3]Pedenson-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-liquid-liquid microextraction for sample preparation of biological fluids prior to capillary eletrophoresis[J]. Analytical Chemistry, 1999, 71:2650-2656．
[4]邵焰，张丽君，张占恩.中空纤维膜-液相微萃取-气相色谱/质谱法测定土壤中拟除虫菊酯类农
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[5] 赵汝松，徐晓白，刘秀芬. 液相微萃取技术的研究进展[J]. 分析化学，2004，32（9）：1246-1251.
【基金项目】大学生创新训练项目“中空纤维液相微萃取检测生物检材中的吗啡（201210175027）”