大庆油污土壤中石油降解菌的筛选和鉴定研究

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  摘要:从大庆油井旁含油土壤中筛选出两株石油降解菌,经过形态观察和生理生化鉴定,最后16SrDNA鉴定。结果表明:C3J1-2為微小杆菌属(Exiguobacterium)、A3J1-1为不动杆菌属(Acinetobacter)。
  关键词:石油降解菌;筛选;鉴定
  石油在开采和运输过程中会发生储油罐泄漏、井喷、输油管道破裂等事故,或是含油废水排放、有害废泥浆排放等不良行为,导致大量石油及其产品污染土壤、破坏植被,严重威胁着生态系统的平衡和安全。[1]探索高效、经济的处理方法修复石油污染土壤,对于生态环境具重要意义。[2]生物修复技术具有环境友好、成本低廉、操作简便、对操作人员危害小、作用彻底等特点,越来越引起人们的重视,被广泛应用到环境污染治理领域。[3]本人从油井附近油污土壤中筛选出三株石油降解菌,经过鉴定其中C3J1-2为微小杆菌属(Exiguobacterium)、E1J4-1和A3J1-1为不动杆菌属(Acinetobacter)。前人关于微小杆菌属(Exiguobacterium)降解石油烃的论文较少。
  1实验方法
  1.1筛选
  参照董丁[4]论文配置培养基《微生物学实验》[5]配置所需培养基,取2g从大庆油井附近采集的油污土,使用前一直置于-80℃环境。将土壤置于含油10%的100ml无机盐培养基中,并加入几颗玻璃珠,在160rpm、30℃条件下摇床震荡培养5d后,取10ml培养液转移转移到新的含油无机盐培养基中,160rpm、37℃条件继续摇床震荡培养5d,连续驯化传代5次。
  取100μL培养液涂布于油平板上,置于37℃培养16h,挑取不同形态和颜色的单菌接种于含油培养基中,连续划线培养3次,直至镜检无杂菌,得到纯化菌株。分离出的菌株转接到石油固体培养基并生长良好,则认为该菌具有潜在的降解石油烃特性,即为待筛菌株。
  1.2鉴定
  观察三株细菌的菌落形态边缘、颜色和透明度等并做好记录,其次参照《微生物学实验》[6-7]进行细菌生理生化试验,最后依据《常见细菌系统鉴定手册》[8]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]对细菌进行鉴定。
  1.316SrDNA鉴定
  参照王立秀[10]研究,利用提取的细菌基因组DNA模板,使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对筛选出的石油降解菌的16SrDNA基因进行扩增。
  2分析
  2.1石油降解菌特征
  通过观察得出:菌株C3J1-2菌落呈圆形、浅黄色、菌落正反面颜色差别不大、有异味、菌落中部凸起、表明光滑、湿润、有光泽、菌落不透明、边缘不整齐;菌株A3J1-1菌落呈圆形、乳白色、菌落正反面颜色差别不大、无异味、菌落中部凸起、表明光滑、湿润、有光泽、菌落不透明、边缘整齐。
  2.2生理生化实验结果
  菌株C3J1-2的革兰氏染色为阳性,接触酶试验阳性,氧化酶阴性,V-P实验阴性,好氧性为阳,硝酸盐为阳,甲基红试验为阴,明胶水解为阳,淀粉水解为阳,油脂水解为阴,石蕊牛奶试验为阴,吲哚试验为阳,葡萄糖发酵不产气;菌株A3J1-1革兰氏染色为阴性,接触酶试验阳性,氧化酶阴性,V-P实验阴性,好氧性为阳,硝酸盐为阴,甲基红试验为阴,明胶水解为阴,淀粉水解为阳,油脂水解阳,石蕊牛奶试验为阳,吲哚试验为阳,葡萄糖发酵不产气。
  2.316SrDNA鉴定
  将测得的16SrDNA序列提交至GenBank,下载同源性达97%以上的序列,用MEGA软件构建系统进化树。最终得出,鉴定C3J1-2为微小杆菌属(Exiguobacterium)、E1J4-1和A3J1-1均为不动杆菌属(Acinetobacter)。
  3结论展望
  最终得出,鉴定C3J1-2为微小杆菌属(Exiguobacterium)、E1J4-1和A3J1-1均为不动杆菌属(Acinetobacter)。本研究丰富了石油烃降解菌的研究,为石油污染的微生物修复提供了菌种资源和相关信息。可以深入进一步研究细菌的具体降解效果,未更好发挥细菌作用提供参考。
  参考文献:
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