目的基因重组构建以单增李斯特菌、绵羊李斯特菌为载体的新型结核疫苗候选株,并进行蛋白表达验证,为结核疫苗研究和结核防控提供新思路和新方法。方法以体外基因连接、质粒转化等技术,将本实验室已有的分别编码结核抗原Ag85C、ESAT-6蛋白的两种基因盒,插入携带单增李斯特菌、绵羊李斯特菌同源序列的打靶质粒中。将打靶质粒电转化单增李斯特菌、绵羊李斯特菌,在42℃和30℃连续传代,利用同源重组杂交原理和基因打靶技术,将打靶质粒携带的两种编码结核抗原的抗原基因盒,分别整合至致病基因(actA和plcB)被敲除的单增李斯特菌、绵羊李斯特菌减毒株及未经减毒的绵羊李斯特菌基因组中。重组菌经蓝白斑、抗生素抗性及PCR筛选,再经Western blot检测其菌体蛋白及分泌蛋白的表达情况。结果构建了携带抗原基因盒的重组菌株5株,其重组基因序列PCR验证结果均符合预期,且测序验证成功;重组菌不携带红霉素抗性基因,表型特征符合预期;其中,重组菌Li-Rv0129c、Li-ΔactAplcB-Rv0129c按预期表达了结核杆菌Ag85C抗原蛋白,Li-ΔactAplcBRv3875按预期表达了结核杆菌ESAT-6抗原蛋白,Lm重组菌未表达相应结核抗原蛋白。结论成功构建并筛选得到3株以绵羊李斯特菌为载体的、携带结核杆菌Rv0129c(编码Ag85C)抗原基因盒或Rv3875(编码ESAT-6)抗原基因盒,且表达相应抗原蛋白的新型结核疫苗候选株。