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摘要：目的 建立熏倒牛药材的质量标准。方法 对熏倒牛药材进行性状鉴别及显微鉴别。采用高效液相色谱法（HPLC）测定熏倒牛药材中木犀草素的含量，流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（48∶52），检测波长350 nm。结果 药材显微结构中导管、腺毛及非腺毛较多，还可见纤维束散在或成束分布，存在花粉粒，叶表皮细胞中可见气孔等结构。药材平均含水量为9.80%，木犀草素平均含量为0.745 mg/g。结论 本试验建立的含量测定方法可用于熏倒牛药材的质量控制。 关键词：熏倒牛；质量标准；木犀草素
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0048-02
藏药熏倒牛为蔷薇纲牻牛儿亚纲熏倒牛科植物Biebersteiniacea的干燥地上部分，藏名音译为明见赛保，民间又称为狼尾巴、臭花椒，主要分布在甘肃、青海、宁夏、四川等地区[1]，具有消炎止痛、清热解毒、清血热、祛风毒的作用，用于治疗各种炎症、丹毒、咽喉肿痛、胃痛、全身水肿、中风、虫蛇咬伤等[2]。笔者前期对熏倒牛药理作用进行了研究[3]。本试验采用显微鉴别、高效液相色谱（HPLC）等方法对熏倒牛药材质量进行研究，旨在为其质量标准的建立提供依据。
1 仪器与试药
SY3200-Y120W/6L超声波清洗仪（上海声源超声波仪器设备有限公司），BS110S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），Waters 600E-2487高效液相色谱仪（美国Waters公司），R-200旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。
木犀草素对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号111520-200504）；甲醇（色谱纯，天津四友公司，批号111124），磷酸（分析纯，天津百世公司，批号111115），娃哈哈纯净水（四川娃哈哈集团，批号20110119）。熏倒牛药材由甘肃农业大学陈垣教授鉴定为熏倒牛Biebersteiniacea的干燥地上部分。
2 方法与结果
2.1 性状鉴别
根粗壮，纺锤形，稀分枝，表皮褐色和黄褐色。茎有明显的纵棱，茎圆柱状，茎表皮黄棕色至棕褐色，密被黑色腺毛和柔毛，质脆，横断面不整齐，髓白色或空心。叶互生，叶片轮廓矩圆状倒披针形，向基部渐狭，叶片2～3回羽状深裂或全裂；小裂片条状披针形，皱缩；两面被柔毛；叶柄长5～10 cm，被黄褐色腺毛和柔毛。花瓣5，倒卵形，淡黄色，排列紧密，与萼片等长或稍短。花萼5，宿存，黑色，被腺毛和柔毛。味苦，气浓臭。
2.2 显微鉴别
对药材进行全粉末透化及不透化制片，叶表皮细胞不透化制片，茎表皮透化及不透化制片，腺毛制片、花粉末制片，并进行显微观察。腺毛褐黄色，有2种：一种具有多列细胞的柄和多细胞球形的头，另一种具有分枝状的结节，结节数多而不等。非腺毛均为单细胞，也分为2种：一种基部多弯曲，呈镰刀状，壁薄，光滑；另一种较平直，表面隐约可见疣状突起，壁薄。纤维众多，多破碎，成束或单个存在。不含淀粉粒，但导管众多，具有螺纹、梯纹、网纹等导管，其中以网纹和孔纹导管为多。叶下表皮细胞排列整齐，细胞中含有众多气孔，叶上表皮细胞有连续的凸起，在表皮细胞下可见多个草酸钙簇晶，单个或成簇排列。尤可见散在的花粉粒。茎表皮细胞中可见众多呈弯曲状、光滑的非腺毛[4]。
2.3 含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流动相：甲醇-0.4%的磷酸水溶液（48∶52）；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；进样量：20 ?L。理论板数按木犀草素峰计算应不低于4 000[6]。色谱图见图1。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品3.8 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，配成浓度为0.152 mg/mL的木犀草素对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取熏倒牛药材粉末（过3号筛）3.0 g，加入2.5 mol/L盐酸甲醇溶液30 mL，水浴中加热回流提取1 h，放冷，再称定质量，用2.5 mol/L盐酸甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，吸取续滤液2 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解残渣并定容于10 mL量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为供试品溶液。
2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，共5份系列工作溶液。分别精密吸取20 ?L，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积对浓度进行线性回归，绘制标准曲线，回归方程为：Y=8.97×107X-1.06×105，r=0.999 9。木犀草素在0.12～0.72 ?g范围内线性良好。
2.3.5 精密度试验 精密吸取木犀草素对照品溶液20 ?L，按上述色谱条件连续进样6次，测定木犀草素的峰面积值，计算得RSD=1.93%，表明仪器精密度良好。
2.3.6 重复性试验 精密称取同一批药材粉末6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 ?L，按干燥品计算木犀草素含量，RSD=2.17%，表明方法的重复性良好。
2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一批药材的供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h进样，每次20 ?L，测定木犀草素的峰面积，RSD=2.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的熏倒牛药材粉末（木犀草素含量0.75 mg/g）1.5 g，共5份，每份精密加入一定量的木犀草素对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。
2.3.9 样品测定 精密取熏倒牛药材，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 ?L，进样测定，以干燥品计算木犀草素的含量。结果见表2。
3 讨论
本试验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水溶液等多个流动相在适当配比时的分离条件，其中以甲醇- 0.4%磷酸水溶液洗脱分离效果最好。
本试验分别考察了以甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、2.5 mol/L盐酸甲醇为提取溶剂，水浴中加热回流提取时对样品中木犀草素含量的影响，结果表明，以2.5 mol/L盐酸甲醇作为溶剂时效果较好。考察了以2.5 mol/L盐酸甲醇作为提取溶剂，按0.5、1.0、1.5 h不同时间回流提取时对样品木犀草素含量的影响，结果表明，提取1.0 h即可。考察了采用10、20、30、40、50 mL不同提取体积的2.5 mol/L盐酸甲醇回流提取时对样品中木犀草素含量的影响，结果表明，溶剂用量为30 mL即可。
本试验建立了测定熏倒牛中木犀草素含量的方法。该方法专属性强，操作简单，结果准确，重复性好，可为建立藏药熏倒牛药材的质量标准提供依据。
参考文献：
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第一卷[M].北京：科学出版社，2004：415.
[2] 杨永昌.藏药志[M].西宁：青海人民出版社，1991：263.
[3] 景明，李炀，王晶晶，等.药理效应对藏药薰倒牛不同提取工艺的评价[J].中国民族医药杂志，2012，18（5）：62-63.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录52.
[5] 王秋玲.HPLC测定独一味中木犀草素的含量[J].微量元素与健康研究， 2006，23（2）：43-44.
（收稿日期：2012-09-06，编辑：陈静）
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0048-02
藏药熏倒牛为蔷薇纲牻牛儿亚纲熏倒牛科植物Biebersteiniacea的干燥地上部分，藏名音译为明见赛保，民间又称为狼尾巴、臭花椒，主要分布在甘肃、青海、宁夏、四川等地区[1]，具有消炎止痛、清热解毒、清血热、祛风毒的作用，用于治疗各种炎症、丹毒、咽喉肿痛、胃痛、全身水肿、中风、虫蛇咬伤等[2]。笔者前期对熏倒牛药理作用进行了研究[3]。本试验采用显微鉴别、高效液相色谱（HPLC）等方法对熏倒牛药材质量进行研究，旨在为其质量标准的建立提供依据。
1 仪器与试药
SY3200-Y120W/6L超声波清洗仪（上海声源超声波仪器设备有限公司），BS110S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），Waters 600E-2487高效液相色谱仪（美国Waters公司），R-200旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。
木犀草素对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号111520-200504）；甲醇（色谱纯，天津四友公司，批号111124），磷酸（分析纯，天津百世公司，批号111115），娃哈哈纯净水（四川娃哈哈集团，批号20110119）。熏倒牛药材由甘肃农业大学陈垣教授鉴定为熏倒牛Biebersteiniacea的干燥地上部分。
2 方法与结果
2.1 性状鉴别
根粗壮，纺锤形，稀分枝，表皮褐色和黄褐色。茎有明显的纵棱，茎圆柱状，茎表皮黄棕色至棕褐色，密被黑色腺毛和柔毛，质脆，横断面不整齐，髓白色或空心。叶互生，叶片轮廓矩圆状倒披针形，向基部渐狭，叶片2～3回羽状深裂或全裂；小裂片条状披针形，皱缩；两面被柔毛；叶柄长5～10 cm，被黄褐色腺毛和柔毛。花瓣5，倒卵形，淡黄色，排列紧密，与萼片等长或稍短。花萼5，宿存，黑色，被腺毛和柔毛。味苦，气浓臭。
2.2 显微鉴别
对药材进行全粉末透化及不透化制片，叶表皮细胞不透化制片，茎表皮透化及不透化制片，腺毛制片、花粉末制片，并进行显微观察。腺毛褐黄色，有2种：一种具有多列细胞的柄和多细胞球形的头，另一种具有分枝状的结节，结节数多而不等。非腺毛均为单细胞，也分为2种：一种基部多弯曲，呈镰刀状，壁薄，光滑；另一种较平直，表面隐约可见疣状突起，壁薄。纤维众多，多破碎，成束或单个存在。不含淀粉粒，但导管众多，具有螺纹、梯纹、网纹等导管，其中以网纹和孔纹导管为多。叶下表皮细胞排列整齐，细胞中含有众多气孔，叶上表皮细胞有连续的凸起，在表皮细胞下可见多个草酸钙簇晶，单个或成簇排列。尤可见散在的花粉粒。茎表皮细胞中可见众多呈弯曲状、光滑的非腺毛[4]。
2.3 含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流动相：甲醇-0.4%的磷酸水溶液（48∶52）；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；进样量：20 ?L。理论板数按木犀草素峰计算应不低于4 000[6]。色谱图见图1。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品3.8 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，配成浓度为0.152 mg/mL的木犀草素对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取熏倒牛药材粉末（过3号筛）3.0 g，加入2.5 mol/L盐酸甲醇溶液30 mL，水浴中加热回流提取1 h，放冷，再称定质量，用2.5 mol/L盐酸甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，吸取续滤液2 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解残渣并定容于10 mL量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为供试品溶液。
2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，共5份系列工作溶液。分别精密吸取20 ?L，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积对浓度进行线性回归，绘制标准曲线，回归方程为：Y=8.97×107X-1.06×105，r=0.999 9。木犀草素在0.12～0.72 ?g范围内线性良好。
2.3.5 精密度试验 精密吸取木犀草素对照品溶液20 ?L，按上述色谱条件连续进样6次，测定木犀草素的峰面积值，计算得RSD=1.93%，表明仪器精密度良好。
2.3.6 重复性试验 精密称取同一批药材粉末6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 ?L，按干燥品计算木犀草素含量，RSD=2.17%，表明方法的重复性良好。
2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一批药材的供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h进样，每次20 ?L，测定木犀草素的峰面积，RSD=2.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的熏倒牛药材粉末（木犀草素含量0.75 mg/g）1.5 g，共5份，每份精密加入一定量的木犀草素对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。
2.3.9 样品测定 精密取熏倒牛药材，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 ?L，进样测定，以干燥品计算木犀草素的含量。结果见表2。
3 讨论
本试验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水溶液等多个流动相在适当配比时的分离条件，其中以甲醇- 0.4%磷酸水溶液洗脱分离效果最好。
本试验分别考察了以甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、2.5 mol/L盐酸甲醇为提取溶剂，水浴中加热回流提取时对样品中木犀草素含量的影响，结果表明，以2.5 mol/L盐酸甲醇作为溶剂时效果较好。考察了以2.5 mol/L盐酸甲醇作为提取溶剂，按0.5、1.0、1.5 h不同时间回流提取时对样品木犀草素含量的影响，结果表明，提取1.0 h即可。考察了采用10、20、30、40、50 mL不同提取体积的2.5 mol/L盐酸甲醇回流提取时对样品中木犀草素含量的影响，结果表明，溶剂用量为30 mL即可。
本试验建立了测定熏倒牛中木犀草素含量的方法。该方法专属性强，操作简单，结果准确，重复性好，可为建立藏药熏倒牛药材的质量标准提供依据。
参考文献：
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第一卷[M].北京：科学出版社，2004：415.
[2] 杨永昌.藏药志[M].西宁：青海人民出版社，1991：263.
[3] 景明，李炀，王晶晶，等.药理效应对藏药薰倒牛不同提取工艺的评价[J].中国民族医药杂志，2012，18（5）：62-63.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录52.
[5] 王秋玲.HPLC测定独一味中木犀草素的含量[J].微量元素与健康研究， 2006，23（2）：43-44.
（收稿日期：2012-09-06，编辑：陈静）