【摘 要】
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提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的基因组DNA,利用PCR扩增活化因子(activator)基因.将扩增产物克隆到pKtac1(含强启动子tac)中,构建含全长activator基因(564bp
【机 构】
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福建农林大学作物学院,福建省农业科学院甘蔗研究所,Institute of Toxicology and Pharmacology for Natural Scientists
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提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的基因组DNA,利用PCR扩增活化因子(activator)基因.将扩增产物克隆到pKtac1(含强启动子tac)中,构建含全长activator基因(564bp)的重组质粒pKtac1-act1和含部分activator基因(409bp)的pKtac1-act2.测序结果发现重组质粒pKtac1-act2的tac启动子-10保守区由TATAAT突变为TATGTT.将pKtac1-act1和pKtac1-act2分别进行酶切和连接,获得重组质粒pKtac1-act3(含启动子-10保守区为TATAAT,409 bp的部分activator基因)和pKtac1-act4(含启动子-10保守区为TATGTT,564 bp的全长activator基因).将4个重组质粒分别转化入宿主菌Escherichia coli HB101中,用酶联免疫分析方法测定细菌总蛋白质中的activator表达量;将pAX1(含3α-hsd/CR基因)分别和4个重组质粒一起转化入宿主菌E.coliHB101中,测定细菌总蛋白质中的3α-hsd/CR和activator的表达量.结果表明:启动子-10保守区为TATAAT的质粒比-10保守区为TATGTT的质粒有更高的转录活性;过量的actvitor表达可能影响质粒pKtac1-act3表达的稳定性;启动子-10区保守序列的下降突变(pKtac1-act2,TATAAT→TATGTT)及tac启动子的丢失(pKtac1-act3,继代培养4次)揭示了宿主菌E. coli HB101的自身防护机制.
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