【摘 要】
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将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平
【机 构】
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军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071;吉林大学生命科学院,长春,130061;
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将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr.利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂(LMW-uPA)突变体(缺失尿激酶原的1-143位氨基酸,Arg156→Lys,Asn302→Ala),用脂质体转染方法将表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK转染CHO-dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选,几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW-UK,其中约50%为表达水平较接近(500-5000 IU/106cells/d)的高表达阳性克隆.用转瓶无血清培养表达水平约为17.5pg/cell/d的rCHO细胞系LB2-UK,收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后,获得的重组蛋白的纯度可以达到99%.用S-2444发色底物法检测,所获得的突变体双链UK比例大于98%.
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