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摘 要：本鉴定旨在探讨SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对穿心莲种子进行鉴别的可行性，为穿心莲种子鉴别及育种研究提供科学依据。本鉴定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对几种不同来源和不同采收期的穿心莲种子进行可溶性蛋白质电泳研究。结果表明：不同产地的穿心莲种子蛋白质电泳图谱之间在谱型和谱带的强弱、蛋白质相对含量上均有一定的差异，不同采收期穿心莲种子蛋白质电泳在蛋白质谱带的强弱上有一定差异。结论是聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可用于穿心莲种子鉴定。
关键词：聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 穿心莲 种子鉴定
穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees为爵床科植物，具有清热解毒、凉血消肿等功能，临床上常用于急性菌痢、胃肠炎、感冒、流脑、气管炎、高血压等疾病的治疗。研究表明，不同产地、不同采收期的穿心莲性状、成分差异较大，种子混杂现象也较严重。中药材种子所含蛋白质的种类和数量携带了其长期演化的遗传特征，具有很高的稳定性和专属性，其真伪和品种鉴别是中药集约化生产的重要环节和前提。1991年国际种子检验协会将蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法。目前，蛋白质电泳技术迅速发展和日臻完善，但大多应用于玉米、棉花等植物中，应用于药用植物的研究尚为数不多。鉴定收集了几种不同产地和不同采收期的穿心莲种子，利用蛋白质电泳技术对其进行检测，旨在为穿心莲种质资源的保护、评价，种子的鉴定及育种提供参考依据。
一、鉴定的材料与方法
1.材料。采集4个不同地区和同一地区3种不同采收期的成熟穿心莲果实，室温下阴干，待果皮自然裂开弹出种子，收集于种子瓶中置室温阴凉处保存。
2.仪器与试剂。鉴定所用仪器：DYY-11型电泳仪，DYCZ-24DN双垂直平电泳槽，TDL80-2B台式离心机、HK3300H超声波清洗器，PHS-30酸度计，HC-TP12-2型架盘药物天平。鉴定所用试剂：甘油，1%（质量浓度）溴酚蓝，考马斯亮蓝R-250染液（取0.04 g考马斯亮蓝R-250，加入甲醇18 mL、蒸馏水18 mL和冰醋酸4 mL，即得），考马斯亮蓝脱色液（10 mL甲醇、10 mL冰醋酸和80 mL蒸馏水混匀），30%（质量浓度，下同）丙烯酰胺，0.8%N，N’-甲叉双丙烯酰胺，10%SDS，10%过硫酸铵，1%溴酚蓝。
3.方法
3.1 样品缓冲液的制备取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%（体积分数）的甘油5 mL、10%（体积分数）的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%（质量分数）溴酚蓝1 mL和蒸馏水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，备用。
3.2 丙烯酰胺储存液100 mL（A液）30%丙烯酰胺、0.8%双丙烯酰胺。
3.3 4×分离胶缓冲液100 mL（B液）2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸馏水21 mL。
3.4 4×浓缩胶缓冲液100 mL（C液）取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸馏水46 mL，即得。
3.5 5%浓缩胶蒸馏水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%过硫酸铵30 μL，TEMED 5 μL。
3.6 12%分离胶A液4 mL，B液2.5 mL，蒸馏水3.5 mL，10%过硫酸铵50 μL，TEMED 5 μL。
3.7样品溶液的制备[8]取穿心莲种子0.5 g，加入稀释5倍的样品缓冲液（pH6.8）2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮（PVP），冰浴下研磨，加入稀释4倍的5%浓缩胶缓冲液1 mL，振摇，混匀，超声20 min，室温离心20 min（4 000 r·min-1）。取上清液，离心20 min（4 000 r·min-1）， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振摇2 min，静止分层。吸取下层液体，加入适量冷丙酮，振摇，置4 ℃冰箱30 min，取出，离心5 s（4 000 r·min-1），弃去丙酮，风干。沉淀物加入样品缓冲液2～3 mL，振摇2 min，超声5～10 min，待溶解完全后，室温下离心5 min（4 000 r·min-1），取上清液，置4 ℃冰箱中存放，备用。
3.8 电泳缓冲液的配制取Tris碱3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸馏水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，备用。
3.9 电泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度12%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分别取样品液25 μL，注入样品槽底部，点样结束后向上槽内加入1滴溴酚蓝指示剂示踪。起始电压控制在120 V，样品进入分离胶后，电压调整为200 V，待指示剂距前沿约1 cm时，停止电泳，迅速取出胶板，标记前沿。
3.10 染色和脱色取出胶板后，用蒸馏水冲洗，随即放入考马斯亮蓝 R250显色液中，置恒温箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更换脱色液（甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸馏水80 mL），至背景清晰为止。拍照、记录。
二、鉴定结果与分析
1.电泳结果不同产地和不同采收期的穿心莲种子蛋白的SDS-PAGE电泳结果制成图表，根据此绘制成电泳图谱。结果显示，不同来源、同一产地不同采收期的穿心莲种子可溶性蛋白质电泳图谱共有11条共有特征带，且谱带清晰，Rf值分别为：0.460、0.471、0.482、0.495、0.512、0.524、0.538、0.825、0.921、0.937，表示其具有的共同遗传基础，可作为鉴定穿心莲种子的重要标记。以一级带、二级带作为主要分析特征，不同产地及不同采收期的穿心莲种子蛋白质谱带具有多条共同谱带，但白云基地采收种子的电泳谱带数目与其他种子有较大差异，有10条特征带。在三级带、四级带和五级带上，一些谱带的数目、迁移率有一定差异。
2.蛋白相对百分含量为了分析蛋白表达量，利用凝胶图像分析软件Band Scan对电泳蛋白图谱进行分析，其中由于有部分谱带的灰度值太低，难以测出其所在区域的蛋白含量。可测得的目的蛋白占总蛋白的百分数结果较为复杂。a～f.分别是编号为a～f的穿心莲种子，穿心莲种子可溶性蛋白电泳图谱显示清晰，穿心莲种子可溶性蛋白电泳图谱分析图结果表明，不同来源地和不同采收期的穿心莲种子蛋白表达量亦存在差异。
三、讨论
穿心莲通常是种子繁殖，故种子的鉴定及其品质极为重要。蛋白质是基因表达产物，具有一定的稳定性，但亦会受环境的影响而发生基因的变异，形成不同的生态型甚至变种。本研究首次利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对4个不同来源地的穿心莲种子及同一产地不同采收期的穿心莲种子水溶性蛋白进行了蛋白質电泳的初步研究。研究结果表明，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可作为鉴定穿心莲种子的生物指征。此外，同一来源不同采收期的穿心莲种子蛋白质电泳图谱在谱带数目、迁移率上具有较高相似性，在蛋白质相对含量上则呈现出一定的差异，提示可以作为穿心莲种子成熟以及最佳采收期的生化标记，相关的研究将在下一步工作开展。为穿心莲种子可溶性蛋白电泳的蛋白表达量提供了数据。本研究表明了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对穿心莲种子进行鉴定及种子品质研究的可行性，为进一步研究穿心莲种质资源的保护、评价及育种提供参考依据。
关键词：聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 穿心莲 种子鉴定
穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees为爵床科植物，具有清热解毒、凉血消肿等功能，临床上常用于急性菌痢、胃肠炎、感冒、流脑、气管炎、高血压等疾病的治疗。研究表明，不同产地、不同采收期的穿心莲性状、成分差异较大，种子混杂现象也较严重。中药材种子所含蛋白质的种类和数量携带了其长期演化的遗传特征，具有很高的稳定性和专属性，其真伪和品种鉴别是中药集约化生产的重要环节和前提。1991年国际种子检验协会将蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法。目前，蛋白质电泳技术迅速发展和日臻完善，但大多应用于玉米、棉花等植物中，应用于药用植物的研究尚为数不多。鉴定收集了几种不同产地和不同采收期的穿心莲种子，利用蛋白质电泳技术对其进行检测，旨在为穿心莲种质资源的保护、评价，种子的鉴定及育种提供参考依据。
一、鉴定的材料与方法
1.材料。采集4个不同地区和同一地区3种不同采收期的成熟穿心莲果实，室温下阴干，待果皮自然裂开弹出种子，收集于种子瓶中置室温阴凉处保存。
2.仪器与试剂。鉴定所用仪器：DYY-11型电泳仪，DYCZ-24DN双垂直平电泳槽，TDL80-2B台式离心机、HK3300H超声波清洗器，PHS-30酸度计，HC-TP12-2型架盘药物天平。鉴定所用试剂：甘油，1%（质量浓度）溴酚蓝，考马斯亮蓝R-250染液（取0.04 g考马斯亮蓝R-250，加入甲醇18 mL、蒸馏水18 mL和冰醋酸4 mL，即得），考马斯亮蓝脱色液（10 mL甲醇、10 mL冰醋酸和80 mL蒸馏水混匀），30%（质量浓度，下同）丙烯酰胺，0.8%N，N’-甲叉双丙烯酰胺，10%SDS，10%过硫酸铵，1%溴酚蓝。
3.方法
3.1 样品缓冲液的制备取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%（体积分数）的甘油5 mL、10%（体积分数）的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%（质量分数）溴酚蓝1 mL和蒸馏水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，备用。
3.2 丙烯酰胺储存液100 mL（A液）30%丙烯酰胺、0.8%双丙烯酰胺。
3.3 4×分离胶缓冲液100 mL（B液）2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸馏水21 mL。
3.4 4×浓缩胶缓冲液100 mL（C液）取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸馏水46 mL，即得。
3.5 5%浓缩胶蒸馏水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%过硫酸铵30 μL，TEMED 5 μL。
3.6 12%分离胶A液4 mL，B液2.5 mL，蒸馏水3.5 mL，10%过硫酸铵50 μL，TEMED 5 μL。
3.7样品溶液的制备[8]取穿心莲种子0.5 g，加入稀释5倍的样品缓冲液（pH6.8）2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮（PVP），冰浴下研磨，加入稀释4倍的5%浓缩胶缓冲液1 mL，振摇，混匀，超声20 min，室温离心20 min（4 000 r·min-1）。取上清液，离心20 min（4 000 r·min-1）， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振摇2 min，静止分层。吸取下层液体，加入适量冷丙酮，振摇，置4 ℃冰箱30 min，取出，离心5 s（4 000 r·min-1），弃去丙酮，风干。沉淀物加入样品缓冲液2～3 mL，振摇2 min，超声5～10 min，待溶解完全后，室温下离心5 min（4 000 r·min-1），取上清液，置4 ℃冰箱中存放，备用。
3.8 电泳缓冲液的配制取Tris碱3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸馏水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，备用。
3.9 电泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度12%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分别取样品液25 μL，注入样品槽底部，点样结束后向上槽内加入1滴溴酚蓝指示剂示踪。起始电压控制在120 V，样品进入分离胶后，电压调整为200 V，待指示剂距前沿约1 cm时，停止电泳，迅速取出胶板，标记前沿。
3.10 染色和脱色取出胶板后，用蒸馏水冲洗，随即放入考马斯亮蓝 R250显色液中，置恒温箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更换脱色液（甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸馏水80 mL），至背景清晰为止。拍照、记录。
二、鉴定结果与分析
1.电泳结果不同产地和不同采收期的穿心莲种子蛋白的SDS-PAGE电泳结果制成图表，根据此绘制成电泳图谱。结果显示，不同来源、同一产地不同采收期的穿心莲种子可溶性蛋白质电泳图谱共有11条共有特征带，且谱带清晰，Rf值分别为：0.460、0.471、0.482、0.495、0.512、0.524、0.538、0.825、0.921、0.937，表示其具有的共同遗传基础，可作为鉴定穿心莲种子的重要标记。以一级带、二级带作为主要分析特征，不同产地及不同采收期的穿心莲种子蛋白质谱带具有多条共同谱带，但白云基地采收种子的电泳谱带数目与其他种子有较大差异，有10条特征带。在三级带、四级带和五级带上，一些谱带的数目、迁移率有一定差异。
2.蛋白相对百分含量为了分析蛋白表达量，利用凝胶图像分析软件Band Scan对电泳蛋白图谱进行分析，其中由于有部分谱带的灰度值太低，难以测出其所在区域的蛋白含量。可测得的目的蛋白占总蛋白的百分数结果较为复杂。a～f.分别是编号为a～f的穿心莲种子，穿心莲种子可溶性蛋白电泳图谱显示清晰，穿心莲种子可溶性蛋白电泳图谱分析图结果表明，不同来源地和不同采收期的穿心莲种子蛋白表达量亦存在差异。
三、讨论
穿心莲通常是种子繁殖，故种子的鉴定及其品质极为重要。蛋白质是基因表达产物，具有一定的稳定性，但亦会受环境的影响而发生基因的变异，形成不同的生态型甚至变种。本研究首次利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对4个不同来源地的穿心莲种子及同一产地不同采收期的穿心莲种子水溶性蛋白进行了蛋白質电泳的初步研究。研究结果表明，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可作为鉴定穿心莲种子的生物指征。此外，同一来源不同采收期的穿心莲种子蛋白质电泳图谱在谱带数目、迁移率上具有较高相似性，在蛋白质相对含量上则呈现出一定的差异，提示可以作为穿心莲种子成熟以及最佳采收期的生化标记，相关的研究将在下一步工作开展。为穿心莲种子可溶性蛋白电泳的蛋白表达量提供了数据。本研究表明了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对穿心莲种子进行鉴定及种子品质研究的可行性，为进一步研究穿心莲种质资源的保护、评价及育种提供参考依据。