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摘要：采用不同方法测定花生壳中黄酮类物质的抗氧化活性，并与常用的合成抗氧化剂的抗氧化性能进行对比。结果表明，天然抗氧化剂黄酮类化合物的抗氧化活性高于合成抗氧化剂TBHQ，且超声波辅助提取法提取花生壳中黄酮类化合物的抗氧化活性明显高于索氏萃取法提取花生壳中黄酮类化合物的抗氧化活性。可见，超声波辅助法提取花生壳中黄酮类化合物是一种简单、可行的方法。
关键词：花生壳；黄酮类化合物；抗氧化剂；抗氧化性；自由基
中图分类号： S565.201文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0306-02
收稿日期：2014-02-27
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303072）；国家自然科学基金青年项目（编号：31301590）；江西省农业科学院博士启动基金（编号：2013CBS002） 。
作者简介：周巾英（1983—），女，江西吉安人，博士，助理研究员，从事天然抗氧化剂研发及其活性的研究。E-mail：lyjgstgzy@126.com。
通信作者：冯健雄，研究员，从事农副产品加工研究。E-mail：fjx630320@163.com。抗氧化剂可分为天然抗氧化剂、合成抗氧化剂，目前使用最多的合成抗氧化剂包括叔丁基-4-甲氧基苯酚（butylated hydroxyanisole，BHA）、定基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、叔丁基氢醌（ter-butylhydroquinone，TBHQ）等，合成抗氧化剂能有效捕捉自由基，从而达到抑制氧化反应进行的目的，但是合成抗氧剂存在危害人类健康的风险[1-2]。由于人工合成的抗氧化剂存在安全隐患，因此，寻求高效、安全的抗氧剂已成为研究热点[3-5]。花生壳营养价值较高，含有多种具有抗氧化活性的物质，其中粗蛋白含量为4.8%～72%，粗脂肪含量为1%，粗纤维含量为65.7%～79.3%，可溶性碳水化合物含量为10.6%～21.2%。花生壳不仅具有降低血压、血脂等作用，还具有抗氧化、抗菌抗炎、增强免疫等药理活性[6-8]。笔者研究采用不同方法提取出的花生壳中黄酮类物质的抗氧化活性，并与常用的合成抗氧化剂的抗氧化性能进行对比，以期为花生壳提取物的应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
二苯基苦味酰基苯肼（2，2-diphenyl-1-picryhydrazyl，DPPH）、2，2-连氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸磷酸氢二胺盐）[2，2′-Azion-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt），ABTS]、无水乙醇、磷酸、高硫酸钾、磷酸钠、钼酸铵、硫酸、紫外-可见分光光度计、分子电子天平、离心机。叔丁基对苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、超声波辅助法提取花生壳中黄酮类化合物（ultrasonic assisted extraction of peanut shell，UEPS）、索氏萃取法提取花生壳中黄酮类化合物（soxhlet extraction of peanut shell，SEPS）。
1.2方法
1.2.1DPPH·自由基清除率的测定根据Hatano等的方法[9]清除DPPH·自由基。在样品管中加入一定量的样品及DPPH·溶液（样品最终浓度为5、7.5、10、12.5、15 μg/mL），摇匀并于30 ℃下放置30 min。在515 nm处测定不同浓度样品与DPPH·反应后的吸光度、样品在无水乙醇溶剂中的吸光度、DPPH·在无水乙醇溶剂中的吸光度，以无水乙醇溶剂为空白样品，TBHQ为参照物，每处理重复3次。
样品的消除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。（1）
式中：D空白代表DPPH·与溶剂混合液的吸光度，D样品代表DPPH·与样品反应后的吸光度，D对照代表样品与溶剂混合的吸光度。
1.2.2ABTS ·自由基清除率的测定ABTS ·工作液配制方法：将5 mL 7 mmol/L ABTS与88 μL 140 mmol/L高硫酸钾混合，室温下避光放置过夜，制成ABTS ·自由基贮备液[10]。使用前用无水乙醇稀释成工作液，并要求其在734 nm处的吸光度约为0.70±0.02。取0.1 mL不同浓度的样品与19 mL ABTS ·工作液混合均匀，室温下避光放置10 min，在734 nm处测定其吸光度，以无水乙醇为空白，TBHQ为参照物，每处理重复3次。
样品的消除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。（2）
式中：D空白代表ABTS ·空白对照吸光度，D样品代表ABTS ·与样品反应后的吸光度，D对照代表样品空白吸光度。
1.2.3总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）的测定分别取不同样品溶液1.0 mL加入10 mL离心管中，再加入3.0 mL磷钼试剂溶液（磷钼试剂溶液包括0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L 磷酸钠、4 mmol/L钼酸铵）混合均匀，混合液在 95 ℃ 水浴锅中分别水浴30、60、90、120、150、180 min，放置冷却至室温，在695 nm处检测样品的吸光度[11]，以蒸馏水为空白，TBHQ为对照，重复3次，取平均值。
1.2.4还原性能力（reducing power）的测定在10 mL离心管中分别加入2.5 mL 0.2 mol/L pH值为 6.6 的磷酸缓冲液及不同含量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL）的黄酮提取液1 mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后50 ℃下放置20 min，取出冷却至室温后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL FeCl3，混匀后静置10 min，在700 nm处检测样品的吸光度，TBHQ作为对照。 2结果与分析
2.1DPPH·自由基清除率
DPPH·自由基是一种以氮为中心的稳定自由基，其乙醇溶液为紫红色，在波长515 nm处有最大吸光度。此方法是基于抗氧化剂能给自由基提供氢原子或电子引起紫红色消褪来检测样品的抗氧化活性。自由基分为羟基自由基、烷基自由基、过氧自由基。若提取物能够清除DPPH·自由基，则表示它含有降低羟基自由基、烷基自由基、过氧自由基有效浓度的能力，可以有效阻断脂质过氧化反应，从而抑制氧化过程。抗氧化剂清除DPPH·自由基的清除率越高，其抗氧化能力越强。由图1可知，UEPS、SEPS对 DPPH· 自由基清除能力较强，并且清除率与黄酮含量呈正相关性，随着黄酮含量的增大，其对DPPH·自由基的清除能力也逐渐增强。UEPS、SEPS对DPPH·自由基的清除率均高于TBHQ，UEPS对 DPPH· 自由基的清除能力高于SEPS。
2.2ABTS ·自由基清除率
ABTS法可用于亲水性、亲脂性物质抗氧化能力检测，ABTS与过硫酸钾反应可生成稳定的蓝绿色工作液即ABTS ·自由基。向ABTS ·工作液中加入抗氧化剂，该抗氧化剂可与ABTS ·反应，ABTS ·将会减少，在734 nm处溶液的吸光度也发生变化，同时ABTS ·工作液褪色，褪色越明显，表明该抗氧化剂的抗氧化能力越强。由图2可知，UEPS、SEPS对ABTS ·自由基清除能力较强，并且清除率与黄酮含量呈正相关性，随着黄酮含量的增大，其对ABTS ·自由基的清除能力也逐渐增强。UEPS、SEPS对ABTS ·自由基的清除率均高于TBHQ，且UEPS对ABTS ·自由基的清除能力高于SEPS。
2.3总抗氧化能力
磷钼络合物法通常被用于酚类、维生素E、类胡萝卜素等抗氧化物的抗氧化活性测定，其原理是抗氧化物质中的氢或电子转移到Mo（Ⅵ）并将其还原成绿色的Mo（Ⅴ）络合物，其最大吸收波长为695 nm，吸光度越大，表示抗氧化剂活性越强。由图3可知，随着反应时间的延长，溶液的吸光度增大，即抗氧化剂的抗氧化活性逐渐增强。UEPS、SEPS抗氧化活性较高，总抗氧化活性的从强到弱依次为UEPS>SEPS>TBHQ。
2.4还原能力
测定还原能力是为了检验样品是否是一个良好的电子供给体，还原能力强的样品是良好的电子供给体，其供给的电子除了把Fe3 还原成Fe2 外，还可与自由基反应，生成稳定的物质。一般情况下，样品的还原能力与其抗氧化活性存在一定的相关性，样品的还原能力可间接反映其抗氧化能力。由图4可知，在所检测的浓度范围内，各个样品的还原能力随着黄酮含量的增加逐渐增强。当检测样品黄酮含量为 1.0 mg/mL 时，UEPS、SEPS、TBHQ在700 nm处对应的吸光度分别为1.956、1.455、0.721，表明不同提取法提取花生壳中黄酮类化合物具有一定的还原能力。在相同含量下，各个样品的还原能力由强到弱依次为UEPS>SEPS>TBHQ。
3结论
本研究表明，UEPS、SEPS、TBHQ均表现出不同程度的抗氧化能力。对DPPH·、APTS 自由基的清除能力由强到弱依次为UEPS>SEPS>TBHQ。花生壳提取出的黄酮类化合物抗氧化活性均高于合成抗氧化剂TBHQ，且超声波辅助提
取法提取花生壳中黄酮类化合物的抗氧化活性明显高于索氏萃取法提取花生壳中黄酮类化合物的抗氧化活性。可见，超声波辅助提取法是一种提取天然活性成分的有效方法。
参考文献：
[1]Zhong S Y，Ma C W，Lin Y C，et al. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp（Hypophthalmichthys molitrix） processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry[J]. Food Chemistry，2011，126（4）：1636-1642.
[2]Goli A H，Barzegar M，Sahari M A. Antioxidant activity and total phenolic compounds of pistachio（Pistachia vera） hull extracts[J]. Food Chemistry，2005，92（3）：521-525.
[3]张守媛，李太衬，栾波，等. 响应面优化茄子皮色素的提取及抗氧化性研究[J]. 中国酿造，2013，32（4）：118-122.
[4]蔡奕文，赵谋明，彭志英. 天然抗氧化剂发展近况[J]. 中国油脂，1999，24（4）：45-47.
[5]周向军，高义霞，谢天柱，等. 天然抗氧化剂茶多酚的研究进展[J]. 资源开发与市场，2010，26（11）：1034-1036.
[6]许晖，孙兰萍，张斌，等. 花生壳黄酮类化合物的研究进展[J]. 农产品加工·学刊，2008，3（3）：11-15.
[7]杨国峰，周建新，汪海峰，等. 花生壳提取物的制备及其抗氧化与抗菌活性的研究进展[J]. 食品与发酵工业，2007，33（2）：97-101.
[8]张伟敏，张盛林，钟耕. 木犀草素的研究概况[J]. 中国食品添加剂，2005（2）：11-16.
[9]Hatano T，Kagawa H，Yasuhara T，et al. Two new flavonoids and other constituents in licorice root：their relative astringency and radical scavenging effects[J]. Chemical
关键词：花生壳；黄酮类化合物；抗氧化剂；抗氧化性；自由基
中图分类号： S565.201文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0306-02
收稿日期：2014-02-27
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303072）；国家自然科学基金青年项目（编号：31301590）；江西省农业科学院博士启动基金（编号：2013CBS002） 。
作者简介：周巾英（1983—），女，江西吉安人，博士，助理研究员，从事天然抗氧化剂研发及其活性的研究。E-mail：lyjgstgzy@126.com。
通信作者：冯健雄，研究员，从事农副产品加工研究。E-mail：fjx630320@163.com。抗氧化剂可分为天然抗氧化剂、合成抗氧化剂，目前使用最多的合成抗氧化剂包括叔丁基-4-甲氧基苯酚（butylated hydroxyanisole，BHA）、定基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、叔丁基氢醌（ter-butylhydroquinone，TBHQ）等，合成抗氧化剂能有效捕捉自由基，从而达到抑制氧化反应进行的目的，但是合成抗氧剂存在危害人类健康的风险[1-2]。由于人工合成的抗氧化剂存在安全隐患，因此，寻求高效、安全的抗氧剂已成为研究热点[3-5]。花生壳营养价值较高，含有多种具有抗氧化活性的物质，其中粗蛋白含量为4.8%～72%，粗脂肪含量为1%，粗纤维含量为65.7%～79.3%，可溶性碳水化合物含量为10.6%～21.2%。花生壳不仅具有降低血压、血脂等作用，还具有抗氧化、抗菌抗炎、增强免疫等药理活性[6-8]。笔者研究采用不同方法提取出的花生壳中黄酮类物质的抗氧化活性，并与常用的合成抗氧化剂的抗氧化性能进行对比，以期为花生壳提取物的应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
二苯基苦味酰基苯肼（2，2-diphenyl-1-picryhydrazyl，DPPH）、2，2-连氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸磷酸氢二胺盐）[2，2′-Azion-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt），ABTS]、无水乙醇、磷酸、高硫酸钾、磷酸钠、钼酸铵、硫酸、紫外-可见分光光度计、分子电子天平、离心机。叔丁基对苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、超声波辅助法提取花生壳中黄酮类化合物（ultrasonic assisted extraction of peanut shell，UEPS）、索氏萃取法提取花生壳中黄酮类化合物（soxhlet extraction of peanut shell，SEPS）。
1.2方法
1.2.1DPPH·自由基清除率的测定根据Hatano等的方法[9]清除DPPH·自由基。在样品管中加入一定量的样品及DPPH·溶液（样品最终浓度为5、7.5、10、12.5、15 μg/mL），摇匀并于30 ℃下放置30 min。在515 nm处测定不同浓度样品与DPPH·反应后的吸光度、样品在无水乙醇溶剂中的吸光度、DPPH·在无水乙醇溶剂中的吸光度，以无水乙醇溶剂为空白样品，TBHQ为参照物，每处理重复3次。
样品的消除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。（1）
式中：D空白代表DPPH·与溶剂混合液的吸光度，D样品代表DPPH·与样品反应后的吸光度，D对照代表样品与溶剂混合的吸光度。
1.2.2ABTS ·自由基清除率的测定ABTS ·工作液配制方法：将5 mL 7 mmol/L ABTS与88 μL 140 mmol/L高硫酸钾混合，室温下避光放置过夜，制成ABTS ·自由基贮备液[10]。使用前用无水乙醇稀释成工作液，并要求其在734 nm处的吸光度约为0.70±0.02。取0.1 mL不同浓度的样品与19 mL ABTS ·工作液混合均匀，室温下避光放置10 min，在734 nm处测定其吸光度，以无水乙醇为空白，TBHQ为参照物，每处理重复3次。
样品的消除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。（2）
式中：D空白代表ABTS ·空白对照吸光度，D样品代表ABTS ·与样品反应后的吸光度，D对照代表样品空白吸光度。
1.2.3总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）的测定分别取不同样品溶液1.0 mL加入10 mL离心管中，再加入3.0 mL磷钼试剂溶液（磷钼试剂溶液包括0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L 磷酸钠、4 mmol/L钼酸铵）混合均匀，混合液在 95 ℃ 水浴锅中分别水浴30、60、90、120、150、180 min，放置冷却至室温，在695 nm处检测样品的吸光度[11]，以蒸馏水为空白，TBHQ为对照，重复3次，取平均值。
1.2.4还原性能力（reducing power）的测定在10 mL离心管中分别加入2.5 mL 0.2 mol/L pH值为 6.6 的磷酸缓冲液及不同含量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL）的黄酮提取液1 mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后50 ℃下放置20 min，取出冷却至室温后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL FeCl3，混匀后静置10 min，在700 nm处检测样品的吸光度，TBHQ作为对照。 2结果与分析
2.1DPPH·自由基清除率
DPPH·自由基是一种以氮为中心的稳定自由基，其乙醇溶液为紫红色，在波长515 nm处有最大吸光度。此方法是基于抗氧化剂能给自由基提供氢原子或电子引起紫红色消褪来检测样品的抗氧化活性。自由基分为羟基自由基、烷基自由基、过氧自由基。若提取物能够清除DPPH·自由基，则表示它含有降低羟基自由基、烷基自由基、过氧自由基有效浓度的能力，可以有效阻断脂质过氧化反应，从而抑制氧化过程。抗氧化剂清除DPPH·自由基的清除率越高，其抗氧化能力越强。由图1可知，UEPS、SEPS对 DPPH· 自由基清除能力较强，并且清除率与黄酮含量呈正相关性，随着黄酮含量的增大，其对DPPH·自由基的清除能力也逐渐增强。UEPS、SEPS对DPPH·自由基的清除率均高于TBHQ，UEPS对 DPPH· 自由基的清除能力高于SEPS。
2.2ABTS ·自由基清除率
ABTS法可用于亲水性、亲脂性物质抗氧化能力检测，ABTS与过硫酸钾反应可生成稳定的蓝绿色工作液即ABTS ·自由基。向ABTS ·工作液中加入抗氧化剂，该抗氧化剂可与ABTS ·反应，ABTS ·将会减少，在734 nm处溶液的吸光度也发生变化，同时ABTS ·工作液褪色，褪色越明显，表明该抗氧化剂的抗氧化能力越强。由图2可知，UEPS、SEPS对ABTS ·自由基清除能力较强，并且清除率与黄酮含量呈正相关性，随着黄酮含量的增大，其对ABTS ·自由基的清除能力也逐渐增强。UEPS、SEPS对ABTS ·自由基的清除率均高于TBHQ，且UEPS对ABTS ·自由基的清除能力高于SEPS。
2.3总抗氧化能力
磷钼络合物法通常被用于酚类、维生素E、类胡萝卜素等抗氧化物的抗氧化活性测定，其原理是抗氧化物质中的氢或电子转移到Mo（Ⅵ）并将其还原成绿色的Mo（Ⅴ）络合物，其最大吸收波长为695 nm，吸光度越大，表示抗氧化剂活性越强。由图3可知，随着反应时间的延长，溶液的吸光度增大，即抗氧化剂的抗氧化活性逐渐增强。UEPS、SEPS抗氧化活性较高，总抗氧化活性的从强到弱依次为UEPS>SEPS>TBHQ。
2.4还原能力
测定还原能力是为了检验样品是否是一个良好的电子供给体，还原能力强的样品是良好的电子供给体，其供给的电子除了把Fe3 还原成Fe2 外，还可与自由基反应，生成稳定的物质。一般情况下，样品的还原能力与其抗氧化活性存在一定的相关性，样品的还原能力可间接反映其抗氧化能力。由图4可知，在所检测的浓度范围内，各个样品的还原能力随着黄酮含量的增加逐渐增强。当检测样品黄酮含量为 1.0 mg/mL 时，UEPS、SEPS、TBHQ在700 nm处对应的吸光度分别为1.956、1.455、0.721，表明不同提取法提取花生壳中黄酮类化合物具有一定的还原能力。在相同含量下，各个样品的还原能力由强到弱依次为UEPS>SEPS>TBHQ。
3结论
本研究表明，UEPS、SEPS、TBHQ均表现出不同程度的抗氧化能力。对DPPH·、APTS 自由基的清除能力由强到弱依次为UEPS>SEPS>TBHQ。花生壳提取出的黄酮类化合物抗氧化活性均高于合成抗氧化剂TBHQ，且超声波辅助提
取法提取花生壳中黄酮类化合物的抗氧化活性明显高于索氏萃取法提取花生壳中黄酮类化合物的抗氧化活性。可见，超声波辅助提取法是一种提取天然活性成分的有效方法。
参考文献：
[1]Zhong S Y，Ma C W，Lin Y C，et al. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp（Hypophthalmichthys molitrix） processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry[J]. Food Chemistry，2011，126（4）：1636-1642.
[2]Goli A H，Barzegar M，Sahari M A. Antioxidant activity and total phenolic compounds of pistachio（Pistachia vera） hull extracts[J]. Food Chemistry，2005，92（3）：521-525.
[3]张守媛，李太衬，栾波，等. 响应面优化茄子皮色素的提取及抗氧化性研究[J]. 中国酿造，2013，32（4）：118-122.
[4]蔡奕文，赵谋明，彭志英. 天然抗氧化剂发展近况[J]. 中国油脂，1999，24（4）：45-47.
[5]周向军，高义霞，谢天柱，等. 天然抗氧化剂茶多酚的研究进展[J]. 资源开发与市场，2010，26（11）：1034-1036.
[6]许晖，孙兰萍，张斌，等. 花生壳黄酮类化合物的研究进展[J]. 农产品加工·学刊，2008，3（3）：11-15.
[7]杨国峰，周建新，汪海峰，等. 花生壳提取物的制备及其抗氧化与抗菌活性的研究进展[J]. 食品与发酵工业，2007，33（2）：97-101.
[8]张伟敏，张盛林，钟耕. 木犀草素的研究概况[J]. 中国食品添加剂，2005（2）：11-16.
[9]Hatano T，Kagawa H，Yasuhara T，et al. Two new flavonoids and other constituents in licorice root：their relative astringency and radical scavenging effects[J]. Chemical