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【摘 要】 目的：对不同来源的金银花类药材的抗菌活性进行研究，比较金银花和山银花的活性，根据研究结果为临床用药和原料生产提供实验依据。方法：测定不同来源对不同菌种MIC50。结果：抗菌活性：山银花>金銀花。
【关键词】 金银花 山银花 抗菌活性 MIC50
【Abstract】 Objective： Provides experimental evidence in vitro antimicrobial therapy for honeysuckle herbs in clinical use.Merhods： The bioactive constituents of Flos Lonicerae and Flos Lonicerae Japonicae extracts was researched as the breakthrough point by agar dilution method in vitro studies.Conclusion： The same source to the same strain ofantibacterial activity of different strains of significant differences. Antibacterial activity of herbal extract difference of different sources on the same strain is also very obvious.
【Key words】 Flos Lonicera and Flos Lonicerae Japonicae； bioactive constituents；antibacterial； MIC50
【中图分类号】 R28 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）03-0203-01
金银花类药材作为常用大宗中药，性甘寒，具有清热解毒、凉散风热之功效，对外感风热及瘟病、热毒血痢、各种痈疽肿毒有疗效。临床上广泛用于急性热病及外科感染性疾病等症，对口腔感染、上呼吸道感染、急性扁桃体炎等有一定疗效。鉴于其用药目的，本实验对金银花类药材多基源品种的抗菌活性进行研究，为临床用药提供实验依据。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
96孔板，3GN120L多点接种仪，接种用竹签，漩涡混合器，超声波提取器，超纯水制备系统，高压灭菌锅，恒温培养箱，MH琼脂培养基，营养肉汤培养基，其余试剂均为分析纯。
菌种：大肠杆菌18株，枯草芽孢杆菌1株，金黄色葡萄球菌27株，表皮葡萄球菌10株。
金银花类药材：红腺忍冬，华南忍冬，灰毡毛忍冬，忍冬和黄褐毛忍冬。以上药材均经鉴定为忍冬属植物的干燥花蕾。
1.2 样品制备
将经恒温干燥的五种来源的花蕾粉碎过60目筛，精密称取药材粉末，用70%乙醇20倍量冷浸12 h，超声提取30 min，过滤，残渣加入70%乙醇10倍量，超声提取30 min，过滤，残渣继续二次提取的步骤，合并滤液，滤液45℃减压回收至5 mL，使生药终浓度为1 g/mL。
1.3 金银花类药材抗菌活性测定
该实验在无菌条件下操作，将实验所需培养基于115℃灭菌20 min，其余实验材料于121℃灭菌20 min。实验步骤如下所述：
菌种接种：将在4℃冰箱中保存的长于斜面培养基中状态良好的菌株用灭菌竹签接种至含2 mL液体培养基的试管中，37℃培养8 h，使其达108 CFU/mL，该过程在酒精灯火焰附近操作，避免染菌。
药液稀释：本次试验采取倍比稀释法，即每组药液移3 mL至第一个EP管，后面8个依次加入1.5 mL灭菌稀释用超纯水，将第一管中的药液移出1.5 mL至第二管，混匀后，移出1.5 mL至第三管，依次进行，直至最后一管移出1.5 mL弃去，得9个浓度的1.5 mL药液。
无菌平板制作：吸取上述各浓度的药液1 mL至无菌平皿中，加入9 mL（55℃恒温保存）MH琼脂培养基，迅速混匀，制成一系列药物浓度的药物平板（100.0、50.00、25.00、12.50、6.250、3.125、1.563、0.7812、0.3906 mg/mL），紫外照射0.5 h。
点样：将事先准备好的菌液（108 CFU/mL）按一定顺序加入96孔板（250 μL/孔），固定在多点接种仪上。设置空白对照：空白1点样前用不含菌液的接种仪接种一块无药平板（未加菌，无药平板，点样前）；空白2在点样前用含菌液的接种仪接种一块无药平板（加菌，无药平板，点样前）；空白3点样后用含菌液的接种仪接种一块无药平板（加菌，无药平板，点样后）。点样时顺序从低浓度药物平板至高浓度药物平板进行。
培养：将上述点样后的含药平板于37℃恒温培养箱中培养18 h。
2 结果与讨论
2.1 菌种的选择
金银花类药材是一类常用的有抗菌活性的清热解毒药，已被制成多种成方制剂，例如金银花注射液、银翘解毒片、银黄片、双黄连注射液等。临床上广泛用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎等病症的治疗。鉴于用药目的，本实验选取呼吸道感染常见的由临床分离得到的四种菌种，即枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，进行了多来源的金银花类药材抗菌活性研究。
2.2 体外抗菌方法的选择
本次实验采用琼脂稀释法，适用于药物浓度相对较高但抗菌活性较抗生素弱的中药提取药液的抗菌实验。该方法可以一次在一块含药平板上接种较多的菌株，能同时对多种细菌进行抗菌活性测定，只需制多个系列稀释度含药平板。但琼脂稀释法对菌种的接种要求严格，必须保证每块平板接种的菌量相等。因此，本次实验采取自动接种仪接种，该法可节省人力，缩短接种时间，使操作简便，结果准确，是一种比较理想的方法。 2.3 数据处理及分析
首先观察测试药物对细菌生长的抑制作用。空白1未长菌；空白2、空白3菌株生长良好，且空白3的菌斑不比空白2的菌斑小（二者几乎一样大小）。只有满足以上要求该次实验数据方可使用。
空白1未长菌，说明实验过程中未染菌；空白2、空白3菌株生长良好，二者菌斑几乎一样大小，说明点样时每次接种的菌量相等。每次接种的菌量并没有因为点样至后期菌液不足造成接种量不等。
比对空白2、空白3平板上的菌斑，未长菌组或者菌斑明显小于空白组的记为“–”，否则为“+”，统计各浓度下出现“+”的频数，输入藥物与统计软件Drug And Statistics ver1.0 （DAS ver1.0）计算各样品的MIC50。
2.4 金银花类药材总提物抗菌活性研究
本实验5种来源的药材对不同菌种的MIC50结果如下
表2-1 MIC50测定结果（mg/mL）
由上述MIC50测定结果可知：a. 五种药材提取物对大肠杆菌及表皮葡萄球菌的MIC50值差异不大，说明不同药材对这两种菌的抑菌活性相似，对于金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌则有显著差异，说明不同药材对这两种菌的抑菌作用存在差异。b. 对于表皮葡萄球菌则红腺忍冬效果最佳，华南忍冬，灰毡毛忍冬。黄褐毛忍冬抗菌活性相差无异。 c.山银花对枯草芽孢杆菌的抑菌作用总体强于其余三种菌种，而金银花对大肠杆菌抑菌作用最强，说明不同来源的药材对不同菌种的敏感性不同。
3 结论
本实验以金银花类药材抗菌活性为切入点进行体外抗菌研究。研究表明，对于本实验收集的5个种的金银花类药材的抗菌活性强弱顺序为：黄褐毛忍冬>红腺忍冬>华南忍冬≈灰毡毛忍冬>忍冬，发现山银花抗菌活性优于金银花，为临床上金银花类药材用于抗菌治疗提供了体外实验依据。
参考文献
[1] Paterson DL， Bonomo RA. Extended spectrum β-lactamases： a clinical update[J]. Clinical Microbiol， 2005， 18（4）： 657-686.
[2] 代春美， 王伽伯， 孔维军， 等. 微量热法研究黄连及其主要组分配伍的抑菌作用[J]. 化学学报， 2010， 68（10）： 936-940.
[3] 李勤凡， 王建华， 张耀相， 等. TMPD体外抑菌试验[J ]. 黑龙江畜牧兽医， 2006（11）： 97-98.
[4] 王清， 朱萱萱， 张赤兵， 等. 金银花提取物抗菌作用的实验研究[J]. 中国医药导刊， 2008， 10（9）： 1428-1430.
[5] 雷志钧， 周日宝， 贺又舜， 等. 灰毡毛忍冬与正品金银花体内抗菌作用的比较[J]. 中医药导报， 2005， 11（9）： 8-9.
[6] 崔永明， 余龙江， 敖明章， 等. 甘草酸的提取及其抑菌活性研究[J]. 天然产物研究与开发， 2006， 18（1）： 428-431.
【关键词】 金银花 山银花 抗菌活性 MIC50
【Abstract】 Objective： Provides experimental evidence in vitro antimicrobial therapy for honeysuckle herbs in clinical use.Merhods： The bioactive constituents of Flos Lonicerae and Flos Lonicerae Japonicae extracts was researched as the breakthrough point by agar dilution method in vitro studies.Conclusion： The same source to the same strain ofantibacterial activity of different strains of significant differences. Antibacterial activity of herbal extract difference of different sources on the same strain is also very obvious.
【Key words】 Flos Lonicera and Flos Lonicerae Japonicae； bioactive constituents；antibacterial； MIC50
【中图分类号】 R28 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）03-0203-01
金银花类药材作为常用大宗中药，性甘寒，具有清热解毒、凉散风热之功效，对外感风热及瘟病、热毒血痢、各种痈疽肿毒有疗效。临床上广泛用于急性热病及外科感染性疾病等症，对口腔感染、上呼吸道感染、急性扁桃体炎等有一定疗效。鉴于其用药目的，本实验对金银花类药材多基源品种的抗菌活性进行研究，为临床用药提供实验依据。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
96孔板，3GN120L多点接种仪，接种用竹签，漩涡混合器，超声波提取器，超纯水制备系统，高压灭菌锅，恒温培养箱，MH琼脂培养基，营养肉汤培养基，其余试剂均为分析纯。
菌种：大肠杆菌18株，枯草芽孢杆菌1株，金黄色葡萄球菌27株，表皮葡萄球菌10株。
金银花类药材：红腺忍冬，华南忍冬，灰毡毛忍冬，忍冬和黄褐毛忍冬。以上药材均经鉴定为忍冬属植物的干燥花蕾。
1.2 样品制备
将经恒温干燥的五种来源的花蕾粉碎过60目筛，精密称取药材粉末，用70%乙醇20倍量冷浸12 h，超声提取30 min，过滤，残渣加入70%乙醇10倍量，超声提取30 min，过滤，残渣继续二次提取的步骤，合并滤液，滤液45℃减压回收至5 mL，使生药终浓度为1 g/mL。
1.3 金银花类药材抗菌活性测定
该实验在无菌条件下操作，将实验所需培养基于115℃灭菌20 min，其余实验材料于121℃灭菌20 min。实验步骤如下所述：
菌种接种：将在4℃冰箱中保存的长于斜面培养基中状态良好的菌株用灭菌竹签接种至含2 mL液体培养基的试管中，37℃培养8 h，使其达108 CFU/mL，该过程在酒精灯火焰附近操作，避免染菌。
药液稀释：本次试验采取倍比稀释法，即每组药液移3 mL至第一个EP管，后面8个依次加入1.5 mL灭菌稀释用超纯水，将第一管中的药液移出1.5 mL至第二管，混匀后，移出1.5 mL至第三管，依次进行，直至最后一管移出1.5 mL弃去，得9个浓度的1.5 mL药液。
无菌平板制作：吸取上述各浓度的药液1 mL至无菌平皿中，加入9 mL（55℃恒温保存）MH琼脂培养基，迅速混匀，制成一系列药物浓度的药物平板（100.0、50.00、25.00、12.50、6.250、3.125、1.563、0.7812、0.3906 mg/mL），紫外照射0.5 h。
点样：将事先准备好的菌液（108 CFU/mL）按一定顺序加入96孔板（250 μL/孔），固定在多点接种仪上。设置空白对照：空白1点样前用不含菌液的接种仪接种一块无药平板（未加菌，无药平板，点样前）；空白2在点样前用含菌液的接种仪接种一块无药平板（加菌，无药平板，点样前）；空白3点样后用含菌液的接种仪接种一块无药平板（加菌，无药平板，点样后）。点样时顺序从低浓度药物平板至高浓度药物平板进行。
培养：将上述点样后的含药平板于37℃恒温培养箱中培养18 h。
2 结果与讨论
2.1 菌种的选择
金银花类药材是一类常用的有抗菌活性的清热解毒药，已被制成多种成方制剂，例如金银花注射液、银翘解毒片、银黄片、双黄连注射液等。临床上广泛用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎等病症的治疗。鉴于用药目的，本实验选取呼吸道感染常见的由临床分离得到的四种菌种，即枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，进行了多来源的金银花类药材抗菌活性研究。
2.2 体外抗菌方法的选择
本次实验采用琼脂稀释法，适用于药物浓度相对较高但抗菌活性较抗生素弱的中药提取药液的抗菌实验。该方法可以一次在一块含药平板上接种较多的菌株，能同时对多种细菌进行抗菌活性测定，只需制多个系列稀释度含药平板。但琼脂稀释法对菌种的接种要求严格，必须保证每块平板接种的菌量相等。因此，本次实验采取自动接种仪接种，该法可节省人力，缩短接种时间，使操作简便，结果准确，是一种比较理想的方法。 2.3 数据处理及分析
首先观察测试药物对细菌生长的抑制作用。空白1未长菌；空白2、空白3菌株生长良好，且空白3的菌斑不比空白2的菌斑小（二者几乎一样大小）。只有满足以上要求该次实验数据方可使用。
空白1未长菌，说明实验过程中未染菌；空白2、空白3菌株生长良好，二者菌斑几乎一样大小，说明点样时每次接种的菌量相等。每次接种的菌量并没有因为点样至后期菌液不足造成接种量不等。
比对空白2、空白3平板上的菌斑，未长菌组或者菌斑明显小于空白组的记为“–”，否则为“+”，统计各浓度下出现“+”的频数，输入藥物与统计软件Drug And Statistics ver1.0 （DAS ver1.0）计算各样品的MIC50。
2.4 金银花类药材总提物抗菌活性研究
本实验5种来源的药材对不同菌种的MIC50结果如下
表2-1 MIC50测定结果（mg/mL）
由上述MIC50测定结果可知：a. 五种药材提取物对大肠杆菌及表皮葡萄球菌的MIC50值差异不大，说明不同药材对这两种菌的抑菌活性相似，对于金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌则有显著差异，说明不同药材对这两种菌的抑菌作用存在差异。b. 对于表皮葡萄球菌则红腺忍冬效果最佳，华南忍冬，灰毡毛忍冬。黄褐毛忍冬抗菌活性相差无异。 c.山银花对枯草芽孢杆菌的抑菌作用总体强于其余三种菌种，而金银花对大肠杆菌抑菌作用最强，说明不同来源的药材对不同菌种的敏感性不同。
3 结论
本实验以金银花类药材抗菌活性为切入点进行体外抗菌研究。研究表明，对于本实验收集的5个种的金银花类药材的抗菌活性强弱顺序为：黄褐毛忍冬>红腺忍冬>华南忍冬≈灰毡毛忍冬>忍冬，发现山银花抗菌活性优于金银花，为临床上金银花类药材用于抗菌治疗提供了体外实验依据。
参考文献
[1] Paterson DL， Bonomo RA. Extended spectrum β-lactamases： a clinical update[J]. Clinical Microbiol， 2005， 18（4）： 657-686.
[2] 代春美， 王伽伯， 孔维军， 等. 微量热法研究黄连及其主要组分配伍的抑菌作用[J]. 化学学报， 2010， 68（10）： 936-940.
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[6] 崔永明， 余龙江， 敖明章， 等. 甘草酸的提取及其抑菌活性研究[J]. 天然产物研究与开发， 2006， 18（1）： 428-431.