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摘要：热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是生物体适应外界不良环境条件的关键蛋白。热休克蛋白90（HSP90）是HSP家族的重要成员。本试验以苜蓿夜蛾为材料提取虫体总RNA，利用RTPCR和RACE技术，扩增得到hsp90基因全长cDNA序列，命名为Hvhsp90（GenBank登录号KF636495）。该序列含有2 472个碱基，包括一个2 154个碱基的开放阅读框，编码一个含717个氨基酸的蛋白，分子量约为82.5 ku，等电点为4.97，且含有5个标签序列及胞质特征序列MEEVD，推导的氨基酸序列与鳞翅目其他昆虫HSP90相似性85%～99%之间。RTPCR结果表明，该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织均有mRNA水平的特异性表达。该基因在大肠杆菌表达系统中进行了诱导表达， 经SDSPAGE和Western blot检测结果表明， HvHSP90能够高效表达，并与预测的融合蛋白分子量相符。
关键词：苜蓿夜蛾； 热休克蛋白90； 克隆； 表达
中图分类号： Q 785
文献标识码： A
热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）又称热激蛋白（heat stress proteins），是生物体在应激情况下细胞内迅速合成的一类蛋白质，其诱导表达是昆虫机体抵抗不良外界环境的重要形式之一，而且昆虫体内热休克蛋白的表达量越高，其抗逆性就越强。除了在高温及其他不良环境因子胁迫下，多种应激源如重金属、饥饿、缺氧和缺血等都可以诱导HSP的表达。HSP编码序列变异比较低，在生物体内普遍存在、具有高度保守性[1]。Ritossa于1962年在试验中发现，将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster Linnaeus）幼虫的饲养温度由25 ℃提高至30 ℃，30 min后，其唾液腺染色体上出现了特殊的“膨突”[2]。Tissieres于1974 年证实发生这种现象的原因是因为这个过程中产生了一系列分子量为70 ku和26 ku的蛋白质[3]，这些蛋白质被命名为热休克蛋白。热休克蛋白不但广泛存在于原核、真核生物中，而且还存在于生物体的不同组织和细胞内。依据分子量的大小分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和一些小分子热休克蛋白[45]，且不同物种的热休克蛋白有很高的同源性[6]。热休克蛋白对维持机体的稳态发挥着重要作用，目前已成为当今世界生命科学各个研究领域的热点。
HSP90是HSPs家族中重要成员，除具有稳定蛋白质结构、参与细胞周期调控的作用，还在生物体的稳态维持中发挥重要作用，如应激损伤、肿瘤、自身免疫性等[7]。研究发现，HSP90在蛋白的折叠、蛋白降解和信号的传导中发挥重要作用[810]，调节微生物体内蛋白，保护细胞活性，在形成真菌耐药性的过程中也同样起着重要的作用[11]。在正常或胁迫条件下的各种类型细胞胞质中都有存在，不论是在高等真核细胞还是在酵母中，HSP90都是和配体转录因子和细胞周期调控因子相互作用的，作为陪伴蛋白与变性蛋白结合，维持它们的折叠状态，避免不可逆的损伤[1217]，还可与蛋白激酶和类固醇激素受体等信号传导蛋白相互作用并形成复合体，使其具有生物活性。在无胁迫条件下，HSP90也是真核生物必不可少的[18]，占细胞内可溶性蛋白的1%～2%[19]，对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥着重要作用[20]。
苜蓿夜蛾[Heliothis viriplaca （Hüfnagel）]属鳞翅目，夜蛾科，是大豆的重要食叶性昆虫。目前，对苜蓿夜蛾的防治主要还是通过喷洒化学杀虫剂这种传统的方法来防除。本研究通过对苜蓿夜蛾HSP90基因cDNA序列进行克隆，获取基因cDNA全长序列，并研究了该基因在不同组织和发育阶段的表达情况，将该基因在大肠杆菌原核系统进行了成功表达，为苜蓿夜蛾分子生物学研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 昆虫材料、试剂、质粒与菌株
于东北农业大学实验实习基地大豆田采集苜蓿夜蛾幼虫，室内用新鲜大豆叶喂养到不同虫态备用。
RNA提取试剂盒TRIzolReagent为Invitrogen公司产品、反转录酶MMLV Reverse Transcriptase、低熔点琼脂糖购自Promega公司；DL2 000 DNA Marker、 DNA胶回收试剂盒、克隆载体pMD18T、Taq plus DNA聚合酶购自TaKaRa公司；受体菌DH5α、BL21和表达载体pET21b由本实验室保存。一抗：碧云天生物技术研究所Histag抗体；新型一步法快速WB试剂盒（鼠）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；DAB染色试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供。
1.2 虫体总RNA的提取
提取苜蓿夜蛾5龄幼虫虫体总RNA，提取方法参照RNA提取试剂盒说明，提取的总RNA放入-80 ℃冰箱中备用。
1.3 利用RTPCR和RACE技术克隆基因cDNA序列
1.3.1 利用RTPCR克隆部分cDNA序列
对报道的两种昆虫谷实夜蛾[Helicoverpa zea （Boddie）]（GQ389710）和棉铃虫[Helicoverpa armigera（Hübner）]（HM593517）的hsp90核苷酸序列进行比较分析，设计一对引物hsp90（c）F： 5′GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT3′ 和hsp90（c）R：5′CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA3′。以Oligo （dt）3siteRoRi primer：5′ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC CAA AGC TTG AAT TCG AGC TCT TTT TTT TTT TTT TTT TT3′为引物，所提取的总RNA为底物反转录合成cDNA，以hsp90（c）F和hsp90（c）R扩增苜蓿夜蛾cDNA序列的部分片段。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回收，与pMD18T vector连接，转化DH5α，菌落在含有氨苄青霉素的平板上进行抗性筛选，对阳性克隆菌株进行酶切和PCR鉴定。连接正确的重组子由上海生工生物工程公司进行序列测定。 1.3.2 利用5′RACE克隆基因的5′端cDNA序列
利用TaKaRa 5′Full RACE Kit克隆基因cDNA 5′端序列。根据已得到的cDNA片段和5′RACE试剂盒中的5′RACE outer primer和5′RACE inner primer分别设计引物Hvhsp90（5）outer primer： 5′TCG ACC ACA CCC TTG ATG AAG TT3′和Hvhsp90（5）inner primer：5′CGC AGT TGT CCA TGA TGA ACA CCC TGC GG3′，以引物5′RACE outer primer 和Hvhsp90（5）outer primer进行第1轮PCR。PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；54.8 ℃，1 min；72 ℃，1 min 10 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取首次扩增产物1 μL，用5′RACE inner primer、Hvhsp90（5）inner primer引物进行第2次PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃，30 s；56.7 ℃，1 min；72 ℃，75 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物回收、与pMD18T载体连接、转化并测序。
1.3.3 克隆基因的3′端cDNA序列
根据得到的cDNA保守区序列设计2个克隆基因3′端的上游引物Hvhsp90（3）outer primer： 5′CTG GCT GAC TTG CTC CGC TAC CAC ACA TCT G3′和Hvhsp90（3）inner primer：5′CCG CAT GAA GGA GAA CCA GAA ACA3′。利用这2个引物与3′RACE outer primer：5′ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC C3′和3′RACE inner primer：5′GGA TCC AAA GCT TGA ATT CGA GC TCT进行3′端cDNA序列克隆。以引物3′RACE outer primer 和Hvhsp90（3）outer primer进行第1轮PCR。PCR 反应条件为： 94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；67 ℃，1 min；72 ℃，1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。取首次扩增产物1 μL，用3′RACE inner primer、Hvhsp90（3）inner primer引物进行第2次PCR扩增，扩增条件为： 94 ℃预变性3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，1 min；72 ℃，55 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增完成后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果正确后用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与pMD18T载体连接、转化、筛选、鉴定、序列测定，方法同上。
1.3.4 全长基因的克隆
对RTPCR和RACE技术克隆得到的各个cDNA序列片段进行拼接得到全长cDNA序列，设计克隆基因全长序列的引物，一次性克隆获得全长序列。
1.4 序列分析
用BioXM软件对获得的cDNA序列进行翻译；ExPASy网站（http：∥ca.expasy.org/tools/）的Compute pI/Mw蛋白分析软件推导氨基酸序列的分子量、等电点；SignalP 4.1 Server进行信号肽的预测；clustalx、MEGA5.0、boxshade软件进行同源性比较和系统进化分析。
1.5 基因mRNA的时空表达研究
提取苜蓿夜蛾幼虫取食期（5龄第2天）、预蛹期、蛹期第2天的虫体和5龄第2天的6个组织（前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、唾腺）的总RNA，3次重复。提取的RNA用DNA酶处理，反转录成cDNA，-20 ℃保存备用。
利用RTPCR进行不同组织和发育阶段表达的鉴定。扩增引物为5′GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT3′和5′CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA3′，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，28 s，30个循环；以βactin作为对照，引物为： 5′CCA ACG GCA TCC ACG AGA CCA3′和5′TCG GCG ATA CCA GGG TAC AT3′，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min； 94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，20 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，PCR产物均经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 Hvhsp90基因的原核表达及重组蛋白的Western blot鉴定
设计表达引物Hvhsp90EcoRI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG和 Hvhsp90XhoI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG，以cDNA为模板扩增Hvhsp90的ORF，得到的目的基因的ORF和原核表达载体pET21b（ ）分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切；两种酶切产物经切胶纯化后，应用T4连接酶重新连接以获得有基因插入的重组质粒，并命名重组质粒为hsp90pET21b。将此重组质粒转化至BL21感受态细胞中，活化后涂于加氨苄青霉素平板（Amp 50 μg/mL），进行37 ℃过夜培养，挑取单菌落于加入氨苄青霉素的LB培养基中培养后提取质粒，利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切并测序鉴定其正确性。次日1∶100接种于LB液体培养基，37 ℃培养至A600 nm为0. 6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，分别在20 ℃和37 ℃下以160 r/min诱导培养12 h后，离心收集菌体，进行SDSPAGE检测。 将分离后的蛋白转印PVDF膜85 min， 用4 ℃保存的TBS杂交膜清洗液洗涤2次，每次5 min。洗涤完成后用配制好的封闭液室温孵育5 min，将膜从封闭液中取出后，浸入蒸馏水中，在水平摇床上以较大转速漂洗2次，每次1 min。将一抗（Histag抗体），抗体反应液HRP（鼠）及抗体稀释液混合而成的抗体孵育液加至膜上，于水平摇床上以适当速度室温孵育40 min左右。将膜放入蒸馏水中漂洗30 s，再用洗涤液漂洗3 min，之后再用蒸馏水漂洗30 s。经充分洗涤后用DAB染色试剂盒显色鉴定表达产物。
2 结果与分析
2.1 hsp90基因cDNA序列的获得
利用RTPCR技术扩增出苜蓿夜蛾hsp90部分cDNA序列，用BLAST软件搜索，找到同源性较高的序列均为昆虫hsp90 cDNA序列，初步断定这段cDNA序列属于昆虫hsp90全长cDNA序列的一部分。利用获得的序列设计克隆基因5′ 和3′ 端的引物，克隆得到基因的5′ 和3′ 端序列，经过序列拼接和全长基因测序得到基因包括完整开放读码框在内的cDNA序列，命名为Hvhsp 90。GenBank登录号为KF636495。该基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列见图1。
2.2 hsp90基因cDNA序列和氨基酸序列分析
苜蓿夜蛾hsp90 cDNA序列含有2 472个碱基，5′端有1个151个碱基的非编码区，3′端含有1个162个碱基的非编码区，包括一个2 154个碱基的开放读码框，编码717个氨基酸组成的多肽，分子量为82.5 ku，多肽的等电点4.97。多肽的13～14位为信号肽切割位点，在36～55（NKEIFLRELISNSSDALDKIR）、102～110（LGTIAKSGT）、126～141（IGQFGVGFYSCYLVAD）、347～356（IKLYVHRVFI）与372～387（GVVDSEDLPLNISRE）为HSP90家族标签序列，C端保守序列为MEEVD。所获得的序列符合HSP90家族所特有的氨基酸序列特征[4]，因此确认该序列是苜蓿夜蛾hsp90基因完整编码区cDNA序列。
2.3 HvHSP90氨基酸序列比对
Hvhsp90核苷酸序列所推导的HvHSP90与已经克隆得到的其他鳞翅目HSP90序列进行了比对。结果表明，苜蓿夜蛾HSP90与夜蛾科的谷实夜蛾（Hzea）（GQ389710）、棉铃虫（H.armigera）（HM593517）、斜纹夜蛾[Spodoptera litura（Fabricius）]（GU230735）、烟实夜蛾[Hassulta （Guenée）]（GU230739）一致性达到99%，与另外几种夜蛾科昆虫甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]（FJ524853）、甘蓝夜蛾[Mamestra brassicae（Linnaeus）]（AB251894）、东方黏虫（Mythimna separata Walker）（GU230737）一致性达到98%，与其他几种鳞翅目昆虫的一致性也在85%以上，如表1。
对苜蓿夜蛾HSP90氨基酸序列与已经克隆得到的其他鳞翅目HSP90序列进行系统进化分析，构建进化树（图2）。系统进化分析结果发现，苜蓿夜蛾的热休克蛋白与同一科的烟实夜蛾、棉铃虫、谷实夜蛾、斜纹夜蛾关系较近，继而与同一目的其他科的关系较近，但与非鳞翅目昆虫关系较远（数据未列出）。
2.4 苜蓿夜蛾hsp90基因mRNA在不同组织中表达
组织特异性表达结果表明，hsp90在苜蓿夜蛾幼虫取食期（5龄第2天）、预蛹期、蛹期（蛹壳形成第2天）等不同发育阶段和5龄幼虫的马氏管、唾腺、中肠、脂肪体、前肠、后肠等不同组织中均有表达（图3），结果表明hsp90基因在昆虫的多个组织中均表达。
2.5 HSP90原核表达和重组蛋白的免疫印迹分析
重组载体hsp90pET21b转化到宿主菌株BL21，并测序验证与本试验克隆所得Hvhsp90无任何碱基突变后确定为阳性克隆，并在菌株中进行异源表达，经IPTG诱导后用10%的凝胶进行SDSPAGE，考马斯亮蓝染色检测结果显示，含hsp90pET21b的菌株表达出大小约82.5 ku的特异性蛋白条带（图4），与理论大小相符，而未插入目的基因的空质粒在相应的位置未出现特异性片段的高效表达。
表达产物经SDSPAGE胶分离，再经转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色后，Western blotting结果表明在82.5 ku左右处有一条明显的杂交带出现（图4），与目标蛋白分子量大小完全吻合，表明该重组质粒可以在重组菌中稳定表达。
3 讨论
昆虫在自然界中遭受到高温胁迫或其他诱导等情况时产生热休克蛋白，它是当今生物抗逆研究的重要内容。该序列含有5个HSP90家族签名序列和C端保守序列MEEVD。通过与其他鳞翅目昆虫HSP90蛋白进行同源性比对和系统进化分析，可以明显看出Hvhsp90所编码的蛋白与夜蛾科的谷实夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾等昆虫HSP90同源性较高，而与鳞翅目非夜蛾科昆虫同源性相对较低。同时，GenBank上登录的棉铃虫有3条hsp90基因，甜菜夜蛾[2122]和东方黏虫中有2条hsp90基因，说明同种昆虫中存在多种不同类型hsp90基因。可在后续的研究中继续克隆苜蓿夜蛾的其他hsp90基因，进一步完善昆虫hsp90基因拷贝数研究。
不同时期和不同组织的表达结果表明，hsp90在苜蓿夜蛾的多个发育阶段和组织均有表达，进一步证实HSP90的生物学功能的重要性。本研究只进行了表达的定性分析，不同发育阶段和组织表达量的差异、不同组织和不同发育阶段的昆虫在高温、低温下的表达量的变化以及该基因沉默时昆虫对外界环境变化的反应可进一步利用实时荧光定量和RNAi技术进行深入研究。 构建的原核表达载体hsp90pET21b在20 ℃和37 ℃诱导表达，经SDSPAGE分离和Western blotting验证，两个温度下该载体均能够在大肠杆菌中高效表达出重组的融合蛋白，且均为包涵体蛋白。该表达系统能否表达出可溶性蛋白可通过进一步的条件优化进行探讨或者利用其他真核表达系统进行研究。表达蛋白的获得为下一步制备单克隆抗体及其生理功能研究奠定基础。
相关研究表明，昆虫经不同温度处理，体内的hsp90表达量随温度的升高明显升高[2324]，表明产生hsp90是昆虫抵御外界不良环境因子的重要途径之一。基于hsp90的重要作用，已有应用RNAi技术防治害虫的报道，如赤拟谷盗注射dsRNA后，虫体的繁殖率下降，寿命明显缩短[25]。本文克隆的全长cDNA序列为进一步研究苜蓿夜蛾的温度耐受能力和相关分子生物学研究奠定基础。
参考文献
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关键词：苜蓿夜蛾； 热休克蛋白90； 克隆； 表达
中图分类号： Q 785
文献标识码： A
热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）又称热激蛋白（heat stress proteins），是生物体在应激情况下细胞内迅速合成的一类蛋白质，其诱导表达是昆虫机体抵抗不良外界环境的重要形式之一，而且昆虫体内热休克蛋白的表达量越高，其抗逆性就越强。除了在高温及其他不良环境因子胁迫下，多种应激源如重金属、饥饿、缺氧和缺血等都可以诱导HSP的表达。HSP编码序列变异比较低，在生物体内普遍存在、具有高度保守性[1]。Ritossa于1962年在试验中发现，将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster Linnaeus）幼虫的饲养温度由25 ℃提高至30 ℃，30 min后，其唾液腺染色体上出现了特殊的“膨突”[2]。Tissieres于1974 年证实发生这种现象的原因是因为这个过程中产生了一系列分子量为70 ku和26 ku的蛋白质[3]，这些蛋白质被命名为热休克蛋白。热休克蛋白不但广泛存在于原核、真核生物中，而且还存在于生物体的不同组织和细胞内。依据分子量的大小分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和一些小分子热休克蛋白[45]，且不同物种的热休克蛋白有很高的同源性[6]。热休克蛋白对维持机体的稳态发挥着重要作用，目前已成为当今世界生命科学各个研究领域的热点。
HSP90是HSPs家族中重要成员，除具有稳定蛋白质结构、参与细胞周期调控的作用，还在生物体的稳态维持中发挥重要作用，如应激损伤、肿瘤、自身免疫性等[7]。研究发现，HSP90在蛋白的折叠、蛋白降解和信号的传导中发挥重要作用[810]，调节微生物体内蛋白，保护细胞活性，在形成真菌耐药性的过程中也同样起着重要的作用[11]。在正常或胁迫条件下的各种类型细胞胞质中都有存在，不论是在高等真核细胞还是在酵母中，HSP90都是和配体转录因子和细胞周期调控因子相互作用的，作为陪伴蛋白与变性蛋白结合，维持它们的折叠状态，避免不可逆的损伤[1217]，还可与蛋白激酶和类固醇激素受体等信号传导蛋白相互作用并形成复合体，使其具有生物活性。在无胁迫条件下，HSP90也是真核生物必不可少的[18]，占细胞内可溶性蛋白的1%～2%[19]，对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥着重要作用[20]。
苜蓿夜蛾[Heliothis viriplaca （Hüfnagel）]属鳞翅目，夜蛾科，是大豆的重要食叶性昆虫。目前，对苜蓿夜蛾的防治主要还是通过喷洒化学杀虫剂这种传统的方法来防除。本研究通过对苜蓿夜蛾HSP90基因cDNA序列进行克隆，获取基因cDNA全长序列，并研究了该基因在不同组织和发育阶段的表达情况，将该基因在大肠杆菌原核系统进行了成功表达，为苜蓿夜蛾分子生物学研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 昆虫材料、试剂、质粒与菌株
于东北农业大学实验实习基地大豆田采集苜蓿夜蛾幼虫，室内用新鲜大豆叶喂养到不同虫态备用。
RNA提取试剂盒TRIzolReagent为Invitrogen公司产品、反转录酶MMLV Reverse Transcriptase、低熔点琼脂糖购自Promega公司；DL2 000 DNA Marker、 DNA胶回收试剂盒、克隆载体pMD18T、Taq plus DNA聚合酶购自TaKaRa公司；受体菌DH5α、BL21和表达载体pET21b由本实验室保存。一抗：碧云天生物技术研究所Histag抗体；新型一步法快速WB试剂盒（鼠）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；DAB染色试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供。
1.2 虫体总RNA的提取
提取苜蓿夜蛾5龄幼虫虫体总RNA，提取方法参照RNA提取试剂盒说明，提取的总RNA放入-80 ℃冰箱中备用。
1.3 利用RTPCR和RACE技术克隆基因cDNA序列
1.3.1 利用RTPCR克隆部分cDNA序列
对报道的两种昆虫谷实夜蛾[Helicoverpa zea （Boddie）]（GQ389710）和棉铃虫[Helicoverpa armigera（Hübner）]（HM593517）的hsp90核苷酸序列进行比较分析，设计一对引物hsp90（c）F： 5′GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT3′ 和hsp90（c）R：5′CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA3′。以Oligo （dt）3siteRoRi primer：5′ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC CAA AGC TTG AAT TCG AGC TCT TTT TTT TTT TTT TTT TT3′为引物，所提取的总RNA为底物反转录合成cDNA，以hsp90（c）F和hsp90（c）R扩增苜蓿夜蛾cDNA序列的部分片段。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物回收，与pMD18T vector连接，转化DH5α，菌落在含有氨苄青霉素的平板上进行抗性筛选，对阳性克隆菌株进行酶切和PCR鉴定。连接正确的重组子由上海生工生物工程公司进行序列测定。 1.3.2 利用5′RACE克隆基因的5′端cDNA序列
利用TaKaRa 5′Full RACE Kit克隆基因cDNA 5′端序列。根据已得到的cDNA片段和5′RACE试剂盒中的5′RACE outer primer和5′RACE inner primer分别设计引物Hvhsp90（5）outer primer： 5′TCG ACC ACA CCC TTG ATG AAG TT3′和Hvhsp90（5）inner primer：5′CGC AGT TGT CCA TGA TGA ACA CCC TGC GG3′，以引物5′RACE outer primer 和Hvhsp90（5）outer primer进行第1轮PCR。PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；54.8 ℃，1 min；72 ℃，1 min 10 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取首次扩增产物1 μL，用5′RACE inner primer、Hvhsp90（5）inner primer引物进行第2次PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃，30 s；56.7 ℃，1 min；72 ℃，75 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物回收、与pMD18T载体连接、转化并测序。
1.3.3 克隆基因的3′端cDNA序列
根据得到的cDNA保守区序列设计2个克隆基因3′端的上游引物Hvhsp90（3）outer primer： 5′CTG GCT GAC TTG CTC CGC TAC CAC ACA TCT G3′和Hvhsp90（3）inner primer：5′CCG CAT GAA GGA GAA CCA GAA ACA3′。利用这2个引物与3′RACE outer primer：5′ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC C3′和3′RACE inner primer：5′GGA TCC AAA GCT TGA ATT CGA GC TCT进行3′端cDNA序列克隆。以引物3′RACE outer primer 和Hvhsp90（3）outer primer进行第1轮PCR。PCR 反应条件为： 94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；67 ℃，1 min；72 ℃，1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。取首次扩增产物1 μL，用3′RACE inner primer、Hvhsp90（3）inner primer引物进行第2次PCR扩增，扩增条件为： 94 ℃预变性3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，1 min；72 ℃，55 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增完成后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果正确后用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与pMD18T载体连接、转化、筛选、鉴定、序列测定，方法同上。
1.3.4 全长基因的克隆
对RTPCR和RACE技术克隆得到的各个cDNA序列片段进行拼接得到全长cDNA序列，设计克隆基因全长序列的引物，一次性克隆获得全长序列。
1.4 序列分析
用BioXM软件对获得的cDNA序列进行翻译；ExPASy网站（http：∥ca.expasy.org/tools/）的Compute pI/Mw蛋白分析软件推导氨基酸序列的分子量、等电点；SignalP 4.1 Server进行信号肽的预测；clustalx、MEGA5.0、boxshade软件进行同源性比较和系统进化分析。
1.5 基因mRNA的时空表达研究
提取苜蓿夜蛾幼虫取食期（5龄第2天）、预蛹期、蛹期第2天的虫体和5龄第2天的6个组织（前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、唾腺）的总RNA，3次重复。提取的RNA用DNA酶处理，反转录成cDNA，-20 ℃保存备用。
利用RTPCR进行不同组织和发育阶段表达的鉴定。扩增引物为5′GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT3′和5′CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA3′，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，28 s，30个循环；以βactin作为对照，引物为： 5′CCA ACG GCA TCC ACG AGA CCA3′和5′TCG GCG ATA CCA GGG TAC AT3′，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min； 94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，20 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，PCR产物均经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 Hvhsp90基因的原核表达及重组蛋白的Western blot鉴定
设计表达引物Hvhsp90EcoRI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG和 Hvhsp90XhoI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG，以cDNA为模板扩增Hvhsp90的ORF，得到的目的基因的ORF和原核表达载体pET21b（ ）分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切；两种酶切产物经切胶纯化后，应用T4连接酶重新连接以获得有基因插入的重组质粒，并命名重组质粒为hsp90pET21b。将此重组质粒转化至BL21感受态细胞中，活化后涂于加氨苄青霉素平板（Amp 50 μg/mL），进行37 ℃过夜培养，挑取单菌落于加入氨苄青霉素的LB培养基中培养后提取质粒，利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切并测序鉴定其正确性。次日1∶100接种于LB液体培养基，37 ℃培养至A600 nm为0. 6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，分别在20 ℃和37 ℃下以160 r/min诱导培养12 h后，离心收集菌体，进行SDSPAGE检测。 将分离后的蛋白转印PVDF膜85 min， 用4 ℃保存的TBS杂交膜清洗液洗涤2次，每次5 min。洗涤完成后用配制好的封闭液室温孵育5 min，将膜从封闭液中取出后，浸入蒸馏水中，在水平摇床上以较大转速漂洗2次，每次1 min。将一抗（Histag抗体），抗体反应液HRP（鼠）及抗体稀释液混合而成的抗体孵育液加至膜上，于水平摇床上以适当速度室温孵育40 min左右。将膜放入蒸馏水中漂洗30 s，再用洗涤液漂洗3 min，之后再用蒸馏水漂洗30 s。经充分洗涤后用DAB染色试剂盒显色鉴定表达产物。
2 结果与分析
2.1 hsp90基因cDNA序列的获得
利用RTPCR技术扩增出苜蓿夜蛾hsp90部分cDNA序列，用BLAST软件搜索，找到同源性较高的序列均为昆虫hsp90 cDNA序列，初步断定这段cDNA序列属于昆虫hsp90全长cDNA序列的一部分。利用获得的序列设计克隆基因5′ 和3′ 端的引物，克隆得到基因的5′ 和3′ 端序列，经过序列拼接和全长基因测序得到基因包括完整开放读码框在内的cDNA序列，命名为Hvhsp 90。GenBank登录号为KF636495。该基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列见图1。
2.2 hsp90基因cDNA序列和氨基酸序列分析
苜蓿夜蛾hsp90 cDNA序列含有2 472个碱基，5′端有1个151个碱基的非编码区，3′端含有1个162个碱基的非编码区，包括一个2 154个碱基的开放读码框，编码717个氨基酸组成的多肽，分子量为82.5 ku，多肽的等电点4.97。多肽的13～14位为信号肽切割位点，在36～55（NKEIFLRELISNSSDALDKIR）、102～110（LGTIAKSGT）、126～141（IGQFGVGFYSCYLVAD）、347～356（IKLYVHRVFI）与372～387（GVVDSEDLPLNISRE）为HSP90家族标签序列，C端保守序列为MEEVD。所获得的序列符合HSP90家族所特有的氨基酸序列特征[4]，因此确认该序列是苜蓿夜蛾hsp90基因完整编码区cDNA序列。
2.3 HvHSP90氨基酸序列比对
Hvhsp90核苷酸序列所推导的HvHSP90与已经克隆得到的其他鳞翅目HSP90序列进行了比对。结果表明，苜蓿夜蛾HSP90与夜蛾科的谷实夜蛾（Hzea）（GQ389710）、棉铃虫（H.armigera）（HM593517）、斜纹夜蛾[Spodoptera litura（Fabricius）]（GU230735）、烟实夜蛾[Hassulta （Guenée）]（GU230739）一致性达到99%，与另外几种夜蛾科昆虫甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]（FJ524853）、甘蓝夜蛾[Mamestra brassicae（Linnaeus）]（AB251894）、东方黏虫（Mythimna separata Walker）（GU230737）一致性达到98%，与其他几种鳞翅目昆虫的一致性也在85%以上，如表1。
对苜蓿夜蛾HSP90氨基酸序列与已经克隆得到的其他鳞翅目HSP90序列进行系统进化分析，构建进化树（图2）。系统进化分析结果发现，苜蓿夜蛾的热休克蛋白与同一科的烟实夜蛾、棉铃虫、谷实夜蛾、斜纹夜蛾关系较近，继而与同一目的其他科的关系较近，但与非鳞翅目昆虫关系较远（数据未列出）。
2.4 苜蓿夜蛾hsp90基因mRNA在不同组织中表达
组织特异性表达结果表明，hsp90在苜蓿夜蛾幼虫取食期（5龄第2天）、预蛹期、蛹期（蛹壳形成第2天）等不同发育阶段和5龄幼虫的马氏管、唾腺、中肠、脂肪体、前肠、后肠等不同组织中均有表达（图3），结果表明hsp90基因在昆虫的多个组织中均表达。
2.5 HSP90原核表达和重组蛋白的免疫印迹分析
重组载体hsp90pET21b转化到宿主菌株BL21，并测序验证与本试验克隆所得Hvhsp90无任何碱基突变后确定为阳性克隆，并在菌株中进行异源表达，经IPTG诱导后用10%的凝胶进行SDSPAGE，考马斯亮蓝染色检测结果显示，含hsp90pET21b的菌株表达出大小约82.5 ku的特异性蛋白条带（图4），与理论大小相符，而未插入目的基因的空质粒在相应的位置未出现特异性片段的高效表达。
表达产物经SDSPAGE胶分离，再经转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色后，Western blotting结果表明在82.5 ku左右处有一条明显的杂交带出现（图4），与目标蛋白分子量大小完全吻合，表明该重组质粒可以在重组菌中稳定表达。
3 讨论
昆虫在自然界中遭受到高温胁迫或其他诱导等情况时产生热休克蛋白，它是当今生物抗逆研究的重要内容。该序列含有5个HSP90家族签名序列和C端保守序列MEEVD。通过与其他鳞翅目昆虫HSP90蛋白进行同源性比对和系统进化分析，可以明显看出Hvhsp90所编码的蛋白与夜蛾科的谷实夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾等昆虫HSP90同源性较高，而与鳞翅目非夜蛾科昆虫同源性相对较低。同时，GenBank上登录的棉铃虫有3条hsp90基因，甜菜夜蛾[2122]和东方黏虫中有2条hsp90基因，说明同种昆虫中存在多种不同类型hsp90基因。可在后续的研究中继续克隆苜蓿夜蛾的其他hsp90基因，进一步完善昆虫hsp90基因拷贝数研究。
不同时期和不同组织的表达结果表明，hsp90在苜蓿夜蛾的多个发育阶段和组织均有表达，进一步证实HSP90的生物学功能的重要性。本研究只进行了表达的定性分析，不同发育阶段和组织表达量的差异、不同组织和不同发育阶段的昆虫在高温、低温下的表达量的变化以及该基因沉默时昆虫对外界环境变化的反应可进一步利用实时荧光定量和RNAi技术进行深入研究。 构建的原核表达载体hsp90pET21b在20 ℃和37 ℃诱导表达，经SDSPAGE分离和Western blotting验证，两个温度下该载体均能够在大肠杆菌中高效表达出重组的融合蛋白，且均为包涵体蛋白。该表达系统能否表达出可溶性蛋白可通过进一步的条件优化进行探讨或者利用其他真核表达系统进行研究。表达蛋白的获得为下一步制备单克隆抗体及其生理功能研究奠定基础。
相关研究表明，昆虫经不同温度处理，体内的hsp90表达量随温度的升高明显升高[2324]，表明产生hsp90是昆虫抵御外界不良环境因子的重要途径之一。基于hsp90的重要作用，已有应用RNAi技术防治害虫的报道，如赤拟谷盗注射dsRNA后，虫体的繁殖率下降，寿命明显缩短[25]。本文克隆的全长cDNA序列为进一步研究苜蓿夜蛾的温度耐受能力和相关分子生物学研究奠定基础。
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