华法林(warfarin)是目前临床上广泛使用的维生素K拮抗剂类口服抗凝血药,用于静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性脑卒中、心脏瓣膜置换术后、房颤等的抗凝治疗和预防。目前临床使用的华法林制剂是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物,其中S-华法林的抗凝活性是R-华法林的2.7-3.8倍,在体内主要由肝脏细胞色素P450 2C9(CYP2C9)进行代谢。CYP2C9基因编码区存在着单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNPs),其中比较重要的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。研究表明,具有这两种突变的个体所需华法林剂量明显降低,出血的风险也随之增加。本课题的前期研究也支持该结论。另外,维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORCl)是体内维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶,华法林可竞争性抑制此酶的作用而达到抗凝效果。近期有不少研究显示VKORC 1(1639G>A)基因多态性可明显影响华法林的个体给药剂量。由于目前国内有关VKORCl及CYP2C9基因多态性与华法林剂量关系的深入系统研究较少,因此本研究希望了解中国人群中这两个基因的分布情况,找到华法林维持剂量与相关基因型及其它相关影响因素之间的定量关系,并尝试建立一个适合中国人群的个体化给药方案。本课题首先建立了CYP2C9和VKORCl基因型的分析方法,采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)方法,对入选的中国健康受试者及长期口服华法林抗凝的患者的CYP2C9和VKORCl基因型分布情况进行了分析。结果表明,健康受试者中CYP2C9*l/*1、*1/*2/和*1/*3基因型的频率分别为90.5%(200/221)、0.5%(1/221)和9.0%(20/221),VKORC1-1639 GG.GA和AA基因型的频率分别为0%(0/221)、17.6%(39/221)和82.4%(182/221)；服用华法林的患者CYP2C9*1/*1、*1/*2和*1/*3基因型的频率分别为91.6%(174/190)、0%(0/190)和8.4%(16/190),VKORC1-1639GG.GA和AA基因型的频率分别为1.1%(2/190)、13.2%(25/190)和85.8%(163/190)。CYP2C9及VKORC1基因型分布在健康人与血栓性疾病患者中是一致的。本课题在健康人中发现了1例CYP2C9*1/*2患者,证实了中国人中存在CYP2C9/2罕见突变。其次,考察了CYP2C9和VKORC1遗传多态性与华法林维持剂量的关系。收集了190例临床使用华法林的患者血标本,测定其CYP2C9和VKORC1,同时记录患者的年龄、性别、体重、身高、白蛋白水平、凝血酶原时间—国际标准化比值(PT-INR)、华法林稳态维持剂量等指标。以不同的基因型分组进行统计分析,结果表明VKORC1(1639G>A)AA组,华法林平均维持剂量明显低于GA+GG组[(2.61±0.841mg/d比(4.44±0.87)mg/d,P<0.0005],CYP2C9*1/*3基因型组华法林平均维持剂量明显低于*1/*1型组[(2.29±0.83)m/d比(2.98±1.09)mg/d,P=0.014].华法林剂量与年龄呈负相关(r=-0.253,P<0.0005),与体重(r=0.306,P<0.0005)、身高(r=0.216,P=0.023)呈正相关,与血清白蛋白及稳态INR值均不相关。多元线性回归分析结果显示,患者的年龄、体重、CYP2C9及VKORCl基因型分别解释了约3.2%、9.1%、4.2%、39.4%的个体用药剂量差异,而身高对华法林剂量影响的差异无统计学意义(P>0.05)。包括年龄、体重、CYP2C9及VKORCl基因型的多变量模型能够最好地估计华法林个体剂量(r2=0.550,P<0.0005),回归方程为：DOSe(Ygenetic)=2.791-0.0127×年龄(y)+0.0239×体重(kg)+0.878×CYP2C9(如为*1/*1基因型取值1,如为*1/*3基因型取值0)—1.792×VKORC1(如为AA基因型取值1,如为GA.GG基因型取值0)。而去除基因型因素只包含临床因素的模型最多只能解释华法林个体剂量差异的12.8%(r2=0.128,P<0.0005),回归方程为：Dose(Yclinical)=1.757-0.012×年龄(y)+0.028×体重(kg)。按剂量分层后,两种模型对于中等剂量(3mg/d～4.5mg/d)的患者预测效果相当(预测剂量在±20%实际剂量的样本比例分别为67.5%和62.5%),而对于低剂量(<3mg/d)和高剂量(>4.5mg/d)者,纳入了遗传因素的模型比仅纳入临床因素的模型提供了更为准确的估计值(低剂量患者中分别为43.5%和30.4%,高剂量患者中分别为71.4%和0%)。再次,对获得的遗传学模型采用数据分割法进行内部验证。按照随机原则将资料完全的156例患者分为58例、51例和47例3份,轮流将其中2份合并作为建模数据,剩余1份作为验证数据,代入建造的模型中得到相应的预测剂量。结果表明,预测剂量在±20%实际剂量的样本比例分别为59.6%(28/47),47.1%(24/51)和55.2(32/58),均值为54.0%,与完整数据模型得到的这一比例(57.1%,89/156)相当,表明验证效果较好。另外,本课题还致力于对长期服用华法林的患者实施抗凝药学实践的模式探索。与临床沟通合作,给医护人员介绍药学相关信息和进展,建立抗凝药历,对患者进行用药教育,并建立华法林抗凝患者信息数据库。此外,还收集若干临床患者的数据对遗传学华法林剂量预测模型进行外部验证,同样得到了较好的效果。实践证明,抗凝宣教、电话随访、及时沟通可明显提高患者的用药依从性和对药师的信赖。本课题得出的初步结论是：1.中国汉族人群的CYP2C9和VKORC1基因型分布有自己的特点,与欧美国家差别较大,而与大多数亚洲国家相似,且国内维、汉族之间也存在较大差异；2.CYP2C9及VKORC1基因型分布在健康人与血栓性疾病患者中是一致的,血栓性疾病风险不会导致相关基因发生变异；3.华法林的维持剂量与年龄、体重及CYP2C、VKORC1基因多态性密切相关,包含遗传因素的华法林剂量预测模型比仅包含临床因素的模型预测效果更好；4.临床药师开展抗凝药学实践可明显改善患者的依从性,使患者从心里更加信赖药师；5.患者用药前进行CYP2C9及VKORC1基因型检测,预测个体的华法林剂量,并配合抗凝药学实践,可能缩短达到稳定剂量的时间,减少抗凝过量的发生,具有积极的临床意义。