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摘要：
目的：比较分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制备的黄连解毒汤提取液的指纹图谱，以验证黄连解毒汤的最佳提取方法。方法：以RP-HPLC法测定SBE法、AE法制备的相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液的指纹图谱。结果： SBE法制备的黄连解毒汤提取液的结果大于AE法制备的黄连解毒汤提取液的结果。结论：SBE法制备的相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液中的成分最多。
关键词：SBE法；AE法；黄连解毒汤；提取液；指纹图谱
【中图分类号】
R195 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0269-02
黄连解毒汤出自《外台秘要》，组方由黄柏、黄芩、黄连、栀子组成，有泻火、解毒、清热之功效[1]。经现代研究证实，其药理活性具有抗炎、抑菌、抗脑缺血缺氧、抗氧化、提高免疫力等主要作用[2]。本文旨在比较分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制备的黄连解毒汤提取液的指纹图谱，以验证黄连解毒汤的最佳提取方法，具体报告如下：
1 仪器与试药
1.1 仪器：电子分析天平（MA110型），精密pH计（pHS-3C型），高效液相色谱仪（Waters-2695），紫外分析仪（UV3010型），医用超声波清洗器（KQ-250E型），中空纤维超滤膜（DH-系列）。
1.2 试药：黄柏饮片、黄芩饮片、黄连饮片，栀子饮片，栀子苷、黄芩素、盐酸小檗碱（中国生物制品研究所），甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、超纯水，三氯甲烷（分析纯）。
2 方法
2.1 样品液制备方法：SBE液制备方法：按照处方的比例精确称取100g方药粗粉（10目-20目），按照SBE法的提取工艺及药材组合方式（黄柏和黄芩合煎，黄连和栀子合煎，然后合并煎液），再分别浸泡30分钟，分别以SBE法进行3次提取，加水量按照药量的10倍、8倍、8倍添加，3煎的pH值分别为2.0、7.0和9.0，提取时间分别为2小时、1.5小时、1.5小时，然后将3煎的提取液过滤、离心，以中空纤维超滤膜（相对分子质量=1000）滤过、浓缩、合并，将提取液定容到500ml，得到相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液（含有200g/L生物药）。
AE液制备方法：按照SBE液制备方法，以乙醇（60﹪）为作溶剂，按照上述方法得到相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液（含有200g/L生物药）。
2.2 供试品溶液制备方法：精确称取2种样品液各10ml，置于蒸发皿内，水浴中蒸发浓缩至近干，加0.8g硅藻土，拌匀、蒸干、研匀，置于磨口三角瓶（100ml）内，加入25ml甲醇溶解，称定质量，进行30分钟超声提取，补足减失质量，以布氏漏斗将残存硅藻土滤除。精密吸取2种滤液各2.5ml，以甲醇定容到10ml，即得到2种供试品溶液（含有20g/L生药）[3]。
2.3 对照品溶液制备方法：精确称取5.10mg栀子苷对照品，2.32mg小檗碱对照品，1.96mg黄芩素对照品，以甲醇定容到10ml，即得。
2.4 色谱条件：PLATISIT C18-色谱柱（25cm*0.46cm，5m）；流动相A：0.1﹪磷酸和0.02 moL/L磷酸二氢钾。流动相B：乙腈；流速：0.8ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：225nm；进样量：20ul。
梯度洗脱
3 方法学考察
3.1 精密度：取供试品SBE溶液，连续进5针，得指纹图谱，计算各峰的保留时间RSD及峰面积RSD。
3.2 重现性：取样品溶液和供试品溶液5份，进样检测，计算各峰的保留时间RSD及峰面积RSD。
3.3 稳定性：取供试品SBE溶液，分别在0H，2H，6H，12H，24H进样检测，计算各峰的保留时间RSD及峰面积RSD。
4 结果
4.1 方法学考察中的精密度、重现性及稳定性均满足要求。各峰Rt（相对保留时间）的RSD<1.0%，各峰相对峰面积RSD<5.0%，溶液在24小时内稳定。
4.2 特征峰，SBE法制备的黄连解毒汤提取液存在23个特征峰，AE法制备的黄连解毒汤提取液缺少5个特征峰。
4.3 重叠率，特征峰相似度以夹角余弦法计算，结果SBE法制备的黄连解毒汤提取液的结果大于AE法制备的黄连解毒汤提取液的结果，这和共有特征峰的重叠率计算结果相符。
4.3 峰面积，比较盐酸小檗碱、黄芩素、栀子苷的指标成分、共有特征峰的总面积，结果SBE法制备的黄连解毒汤提取液的结果大于AE法制备的黄连解毒汤提取液的结果。
3 讨论
相关研究显示，对380多种常用中药的活性成分进行统计分析，多数中药的相对分子质量在1000以下，这符合“中药活性成分分子量表”的统计结果，所以本研究以相对分子质量小于等于1000的提取液测定指纹图谱，是中药整体、客观、模糊、综合的特点予以体现，为研究现代药物的新剂型提供有效的技术支持，为提取中药未知物质拓展思路[4]。SBE法（半仿生提取法）是依据中药及方剂中的部分已知成分，结合整体的药物研究方法和分子药物的研究方法，从生物药剂学的角度，对口服给药、药物胃肠道转运过程进行模拟，为中药制剂（经消化道给药）设计出新的提取技术。该方法的提取工艺重视有成分论和药效学反应，综合评价总浸出物、有效成分、不同极性部分的指标及药理作用，对提取工艺进行优选，重视综合成分作用。本研究显示，SBE法在提高有效成分提取率、药学指标方面优于AE法。
综上所述，SBE法制备的相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液中的成分最多。
参考文献
[1]陈丽静，孙秀梅，张兆旺，等.3种方法制备的黄连解毒汤提取液指纹图谱比较[J].中草药，2013，43（3）：487-491.
[2]彭娟，郭娜，范斌，等.黄连解毒汤高效液相色谱指纹图谱研究及指标成分的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：67-70.
[3]沈嘉，曹现峰，刘九飞.几种黄连解毒汤的HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2003，25（6）：434.
[4]窦锦明，孙秀梅，张兆旺，等.黄连解毒汤方药3种方法提取液成分比较[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1369-1371.
目的：比较分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制备的黄连解毒汤提取液的指纹图谱，以验证黄连解毒汤的最佳提取方法。方法：以RP-HPLC法测定SBE法、AE法制备的相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液的指纹图谱。结果： SBE法制备的黄连解毒汤提取液的结果大于AE法制备的黄连解毒汤提取液的结果。结论：SBE法制备的相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液中的成分最多。
关键词：SBE法；AE法；黄连解毒汤；提取液；指纹图谱
【中图分类号】
R195 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0269-02
黄连解毒汤出自《外台秘要》，组方由黄柏、黄芩、黄连、栀子组成，有泻火、解毒、清热之功效[1]。经现代研究证实，其药理活性具有抗炎、抑菌、抗脑缺血缺氧、抗氧化、提高免疫力等主要作用[2]。本文旨在比较分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制备的黄连解毒汤提取液的指纹图谱，以验证黄连解毒汤的最佳提取方法，具体报告如下：
1 仪器与试药
1.1 仪器：电子分析天平（MA110型），精密pH计（pHS-3C型），高效液相色谱仪（Waters-2695），紫外分析仪（UV3010型），医用超声波清洗器（KQ-250E型），中空纤维超滤膜（DH-系列）。
1.2 试药：黄柏饮片、黄芩饮片、黄连饮片，栀子饮片，栀子苷、黄芩素、盐酸小檗碱（中国生物制品研究所），甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、超纯水，三氯甲烷（分析纯）。
2 方法
2.1 样品液制备方法：SBE液制备方法：按照处方的比例精确称取100g方药粗粉（10目-20目），按照SBE法的提取工艺及药材组合方式（黄柏和黄芩合煎，黄连和栀子合煎，然后合并煎液），再分别浸泡30分钟，分别以SBE法进行3次提取，加水量按照药量的10倍、8倍、8倍添加，3煎的pH值分别为2.0、7.0和9.0，提取时间分别为2小时、1.5小时、1.5小时，然后将3煎的提取液过滤、离心，以中空纤维超滤膜（相对分子质量=1000）滤过、浓缩、合并，将提取液定容到500ml，得到相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液（含有200g/L生物药）。
AE液制备方法：按照SBE液制备方法，以乙醇（60﹪）为作溶剂，按照上述方法得到相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液（含有200g/L生物药）。
2.2 供试品溶液制备方法：精确称取2种样品液各10ml，置于蒸发皿内，水浴中蒸发浓缩至近干，加0.8g硅藻土，拌匀、蒸干、研匀，置于磨口三角瓶（100ml）内，加入25ml甲醇溶解，称定质量，进行30分钟超声提取，补足减失质量，以布氏漏斗将残存硅藻土滤除。精密吸取2种滤液各2.5ml，以甲醇定容到10ml，即得到2种供试品溶液（含有20g/L生药）[3]。
2.3 对照品溶液制备方法：精确称取5.10mg栀子苷对照品，2.32mg小檗碱对照品，1.96mg黄芩素对照品，以甲醇定容到10ml，即得。
2.4 色谱条件：PLATISIT C18-色谱柱（25cm*0.46cm，5m）；流动相A：0.1﹪磷酸和0.02 moL/L磷酸二氢钾。流动相B：乙腈；流速：0.8ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：225nm；进样量：20ul。
梯度洗脱
3 方法学考察
3.1 精密度：取供试品SBE溶液，连续进5针，得指纹图谱，计算各峰的保留时间RSD及峰面积RSD。
3.2 重现性：取样品溶液和供试品溶液5份，进样检测，计算各峰的保留时间RSD及峰面积RSD。
3.3 稳定性：取供试品SBE溶液，分别在0H，2H，6H，12H，24H进样检测，计算各峰的保留时间RSD及峰面积RSD。
4 结果
4.1 方法学考察中的精密度、重现性及稳定性均满足要求。各峰Rt（相对保留时间）的RSD<1.0%，各峰相对峰面积RSD<5.0%，溶液在24小时内稳定。
4.2 特征峰，SBE法制备的黄连解毒汤提取液存在23个特征峰，AE法制备的黄连解毒汤提取液缺少5个特征峰。
4.3 重叠率，特征峰相似度以夹角余弦法计算，结果SBE法制备的黄连解毒汤提取液的结果大于AE法制备的黄连解毒汤提取液的结果，这和共有特征峰的重叠率计算结果相符。
4.3 峰面积，比较盐酸小檗碱、黄芩素、栀子苷的指标成分、共有特征峰的总面积，结果SBE法制备的黄连解毒汤提取液的结果大于AE法制备的黄连解毒汤提取液的结果。
3 讨论
相关研究显示，对380多种常用中药的活性成分进行统计分析，多数中药的相对分子质量在1000以下，这符合“中药活性成分分子量表”的统计结果，所以本研究以相对分子质量小于等于1000的提取液测定指纹图谱，是中药整体、客观、模糊、综合的特点予以体现，为研究现代药物的新剂型提供有效的技术支持，为提取中药未知物质拓展思路[4]。SBE法（半仿生提取法）是依据中药及方剂中的部分已知成分，结合整体的药物研究方法和分子药物的研究方法，从生物药剂学的角度，对口服给药、药物胃肠道转运过程进行模拟，为中药制剂（经消化道给药）设计出新的提取技术。该方法的提取工艺重视有成分论和药效学反应，综合评价总浸出物、有效成分、不同极性部分的指标及药理作用，对提取工艺进行优选，重视综合成分作用。本研究显示，SBE法在提高有效成分提取率、药学指标方面优于AE法。
综上所述，SBE法制备的相对分子质量小于等于1000的黄连解毒汤提取液中的成分最多。
参考文献
[1]陈丽静，孙秀梅，张兆旺，等.3种方法制备的黄连解毒汤提取液指纹图谱比较[J].中草药，2013，43（3）：487-491.
[2]彭娟，郭娜，范斌，等.黄连解毒汤高效液相色谱指纹图谱研究及指标成分的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：67-70.
[3]沈嘉，曹现峰，刘九飞.几种黄连解毒汤的HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2003，25（6）：434.
[4]窦锦明，孙秀梅，张兆旺，等.黄连解毒汤方药3种方法提取液成分比较[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1369-1371.