采用4-氯-7-硝基苯-2-噁-1,3-二唑(NBD-Cl)作为柱前衍生试剂,建立了柱前衍生化-高效液相色谱法(HPLC)结合荧光检测器测定安立生坦合成过程中使用的手性拆分剂L-脯氨酸甲酯的方法。考察了衍生反应温度、时间、衍生试剂加入量、缓冲液pH对L-脯氨酸甲酯衍生反应的影响。结果表明,衍生反应优化条件为:反应温度60℃,反应时间60 min,衍生试剂加入量为每毫升反应体系中加入0.3 mg NBD-Cl,衍生反应缓冲液pH为9.0。同时对此方法进行了方法学验证,L-脯氨酸甲酯在0.625~7.5μg/mL范围内线性关系良好,r=0.999 4;检测限为2.5×10-3μg/mL,定量限为7.5×10-3μg/mL;平均回收率为91.9%~106.4%;重复性实验中RSD为0.33%;此方法耐用性良好,L-脯氨酸甲酯样品溶液及衍生产物溶液体系稳定。此方法灵敏、简便、专属性强,能对安立生坦原料药中残留的杂质L-脯氨酸甲酯进行检测及定量分析。