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摘 要：为探索松乳菇分离培养条件，通过不同部位组织分离法对不同培养基进行松乳菇分离培养，分析了松乳菇菌柄、菌肉、菌柄与菌肉交界处组织分离的菌丝萌发和污染情况，以及4种培养基对松乳菇菌丝生长的影响。结果表明，从松乳菇菌柄与菌肉交界处进行组织分离的菌丝萌发率大、污染率小、分离成功率高;松乳菇菌丝在酵母葡萄糖培养基上生长速率快、长势好，在PDA中添加干松针浸出液有利于松乳菇菌丝的培养。
关键词：松乳菇;菌丝培养;组织分离法;培养基
松乳菇（Lactarius deliciosus），隶属于担子菌门（Basidiomycota）、蘑菇目（Agaricales）、红菇科（Russulaceae）、乳菇属（Lactarius），别名松树菌、松菌、紫花菌、美味松乳菇，是一种外生菌根真菌，其味道鲜美，具有较高的营养价值和生态价值，是兼具食药用价值的珍贵食用菌，深受国内外市场欢迎[1-2]。因松乳菇菌丝生长缓慢，需与宿主植物建立共生关系，且在适宜的生态条件下才能产生子实体，所以难以进行人工栽培[3]。目前，在新西兰等国进行了松乳菇仿野生人工栽培并获得成功[4-5]，但国内鲜见相关报道，且松乳菇菌种分离培养难度大，不同的分离培养条件对松乳菇菌丝生长有着较大的影响[6-8]。
本研究通过考察不同部位组织分离法和不同培养基对松乳菇菌丝培养的影响，为成功获得松乳菇菌种及后续开展松乳菇仿人工栽培提供依据。
1 材料与方法
松乳菇为采集自贵阳市高坡市场的野生松乳菇，子实体完整，无损伤。
1.1 试剂
葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O为分析纯（AR）;酵母粉为生化试剂（BR）;马铃薯、鲜松针、干松针等为市场购买。
1.2 培养基
（1）马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH值自然;
（2）酵母葡萄糖培养基（JM）：酵母浸出粉5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O为0.5 g，KH2PO4为1 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH值自然;
（3）鲜松针PDA培养基（SXZ）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，鲜松针浸出液（鲜松针200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然;
（4）干松针PDA培养基（SXG）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，干松针浸出液（干松针200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然。
1.3 方法
1.3.1 不同部位组织分离
挑选2个新鲜的野生松乳菇子实体，用软刷去除表面杂质，再用75%酒精擦拭表面1～2次。在超净工作台上，用手将消毒处理过的松乳菇子实体从中间一分为二掰开，尽量不要触碰到子实体内部，然后用经过灭菌处理的解剖刀分别从菌柄、菌柄与菌肉交界处、菌肉3个部位，切取2～3 mm大小的组织块放入PDA平板培养基上，每个处理3个重复，于25 ℃恒温培养箱内避光培养，记录不同部位组织分离的菌丝萌发、污染等情况。
萌发率=萌发数量/分离总数×100%;污染率=污染数量/分离总数×100%;成功率=成功数量/分离总数×100%。
1.3.2 菌种保存与活化
待菌丝萌发后，选取无污染、长势好的菌丝再次转入PDA培养基上培养，菌丝接近长满平板表面时转入PDA斜面试管中，于4 ℃温度条件的冰箱内保存。将保存的松乳菇菌株接种到PDA平板培养基，活化10～20 d备用。
1.3.3 不同培养基接种
分别将酵母葡萄糖培养基、鲜松针PDA培养基和干松针PDA培养基制作成平板（D=9 cm）培养基，挑取1块活化的松乳菇菌块（0.3 cm2）接种到培养基中央，马铃薯葡萄糖培养基作为对照组，每个处理5个重复，25 ℃恒温避光培养35 d，观察并测定松乳菇菌落形态、菌丝长势、颜色、生长速率等。
2 結果与分析
2.1 不同部位组织分离法对松乳菇分离的影响
采用组织分离法对松乳菇的不同部位进行分离试验，结果如表1所示。由表1可见，松乳菇子实体不同部位组织分离的污染率由大至小分别为：菌柄>菌肉>菌柄与菌肉交界处;从萌发情况来看，菌柄与菌肉交界处萌发数量较多，自菌肉和菌柄部位分离的部位萌发率较低;分离成功率最高的为菌柄与菌肉交界处，成功率最低的为菌柄处。
2.2 不同培养基对松乳菇菌丝培养的影响
2.2.1 菌丝和菌落特征
由图1可见，在不同的培养基上松乳菇的菌丝和菌落形态有较大差异。在SXG和PDA培养基上，菌落呈棕黄色，随着培养时间延长，颜色不断加深，部分有纵向钩纹形成，菌丝粗壮，呈针尖状，平匍或稍向空中延生生长;在SXZ培养基上，菌块周围有暗色色素沉淀的晕圈，菌落棕黄偏橘色，菌丝较细短，呈茸毛状，部分产生溶解性菌液;在JM培养基上，菌落初期白色，后呈淡黄色，菌丝细密，匍匐贴壁生长。
2.2.2 菌丝生长速度
由表2可以得知，随着培养时间的增加，4种培养基上松乳菇菌丝开始萌发、生长，在20～25 d前菌丝生长较快、菌落直径不断增大;25～30 d后菌丝生长变缓慢、菌落直径增幅变化不大。其中，菌丝在JM培养基上生长速度最快，菌落直径最大，在第35天时菌落直径达到最大值31.90 mm;其次是在SXG和PDA培养基上，第30天时菌落直径分别达到8.41 mm和6.53 mm;而在SXZ培养基上，第25天时菌落直径只有4.96 mm，之后菌丝停止生长。 3 讨论
通过比较不同部位组织分离法和不同培养基对松乳菇分离及菌丝培养产生的影响，结果表明，在进行松乳菇组织分离时，选取松乳菇菌柄和菌肉交界處的组织块更有利于菌种分离成功;选择以酵母浸出粉作为氮源的JM培养基有利于松乳菇菌丝快速生长;在PDA中添加干松针浸出液有利于菌丝形成;但在PDA中添加鲜松针浸出液则不利于菌丝生长，甚至会产生抑制作用。
参考文献：
[ 1 ] 张光亚.中国食用菌图鉴[M].昆明：云南科技出版社，1999.
[ 2 ] 敖常伟，惠明，李忠海，等.松乳菇营养成分分析及松乳菇多糖的提取分离[J].食品工业科技，2003，24（9）：77-79.
[ 3 ] 栾庆书，王琴，赵瑞兴，等.外生菌根真菌研究法（第1版）[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2004.
[ 4 ] Alexis Guerin-Laguette，Nicholas Cummings，Ruth CatherineButler，et al.Lactarius deliciosus and Pinus radiata in NewZealand： towards the development of innovative gourmetmushroom orchards[J].Mycorrhiza，2014，24（7）： 511-523.
[ 5 ] Guerin-Laguette A，Plassard C，Mousain D.Effects of experi-mental conditions on mycorrhizal relationships betweenPinus sylvestris and Lactarius deliciosus and unprecedentedfruit-body formation of the Saffron milk cap under controlledconditions[J].Canandian Journal of Microbiology，2000，46（9）：790-799.
[ 6 ] 罗振敏.野生松乳菇菌丝在不同培养基上的分离试验[J].现代农业科技，2010（3）：146.
[ 7 ] 罗晓蔓，周书宇，杨雪.植物根系分泌物的分类和作用[J].安徽农业科学，2019，47（4）：37-39.
[ 8 ] 刘军，温学森，郎爱东.植物根系分泌物成分及其作用的研究进展[J].食品与安全，2007，9（3A）：63-65.
关键词：松乳菇;菌丝培养;组织分离法;培养基
松乳菇（Lactarius deliciosus），隶属于担子菌门（Basidiomycota）、蘑菇目（Agaricales）、红菇科（Russulaceae）、乳菇属（Lactarius），别名松树菌、松菌、紫花菌、美味松乳菇，是一种外生菌根真菌，其味道鲜美，具有较高的营养价值和生态价值，是兼具食药用价值的珍贵食用菌，深受国内外市场欢迎[1-2]。因松乳菇菌丝生长缓慢，需与宿主植物建立共生关系，且在适宜的生态条件下才能产生子实体，所以难以进行人工栽培[3]。目前，在新西兰等国进行了松乳菇仿野生人工栽培并获得成功[4-5]，但国内鲜见相关报道，且松乳菇菌种分离培养难度大，不同的分离培养条件对松乳菇菌丝生长有着较大的影响[6-8]。
本研究通过考察不同部位组织分离法和不同培养基对松乳菇菌丝培养的影响，为成功获得松乳菇菌种及后续开展松乳菇仿人工栽培提供依据。
1 材料与方法
松乳菇为采集自贵阳市高坡市场的野生松乳菇，子实体完整，无损伤。
1.1 试剂
葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O为分析纯（AR）;酵母粉为生化试剂（BR）;马铃薯、鲜松针、干松针等为市场购买。
1.2 培养基
（1）马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH值自然;
（2）酵母葡萄糖培养基（JM）：酵母浸出粉5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O为0.5 g，KH2PO4为1 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH值自然;
（3）鲜松针PDA培养基（SXZ）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，鲜松针浸出液（鲜松针200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然;
（4）干松针PDA培养基（SXG）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，干松针浸出液（干松针200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然。
1.3 方法
1.3.1 不同部位组织分离
挑选2个新鲜的野生松乳菇子实体，用软刷去除表面杂质，再用75%酒精擦拭表面1～2次。在超净工作台上，用手将消毒处理过的松乳菇子实体从中间一分为二掰开，尽量不要触碰到子实体内部，然后用经过灭菌处理的解剖刀分别从菌柄、菌柄与菌肉交界处、菌肉3个部位，切取2～3 mm大小的组织块放入PDA平板培养基上，每个处理3个重复，于25 ℃恒温培养箱内避光培养，记录不同部位组织分离的菌丝萌发、污染等情况。
萌发率=萌发数量/分离总数×100%;污染率=污染数量/分离总数×100%;成功率=成功数量/分离总数×100%。
1.3.2 菌种保存与活化
待菌丝萌发后，选取无污染、长势好的菌丝再次转入PDA培养基上培养，菌丝接近长满平板表面时转入PDA斜面试管中，于4 ℃温度条件的冰箱内保存。将保存的松乳菇菌株接种到PDA平板培养基，活化10～20 d备用。
1.3.3 不同培养基接种
分别将酵母葡萄糖培养基、鲜松针PDA培养基和干松针PDA培养基制作成平板（D=9 cm）培养基，挑取1块活化的松乳菇菌块（0.3 cm2）接种到培养基中央，马铃薯葡萄糖培养基作为对照组，每个处理5个重复，25 ℃恒温避光培养35 d，观察并测定松乳菇菌落形态、菌丝长势、颜色、生长速率等。
2 結果与分析
2.1 不同部位组织分离法对松乳菇分离的影响
采用组织分离法对松乳菇的不同部位进行分离试验，结果如表1所示。由表1可见，松乳菇子实体不同部位组织分离的污染率由大至小分别为：菌柄>菌肉>菌柄与菌肉交界处;从萌发情况来看，菌柄与菌肉交界处萌发数量较多，自菌肉和菌柄部位分离的部位萌发率较低;分离成功率最高的为菌柄与菌肉交界处，成功率最低的为菌柄处。
2.2 不同培养基对松乳菇菌丝培养的影响
2.2.1 菌丝和菌落特征
由图1可见，在不同的培养基上松乳菇的菌丝和菌落形态有较大差异。在SXG和PDA培养基上，菌落呈棕黄色，随着培养时间延长，颜色不断加深，部分有纵向钩纹形成，菌丝粗壮，呈针尖状，平匍或稍向空中延生生长;在SXZ培养基上，菌块周围有暗色色素沉淀的晕圈，菌落棕黄偏橘色，菌丝较细短，呈茸毛状，部分产生溶解性菌液;在JM培养基上，菌落初期白色，后呈淡黄色，菌丝细密，匍匐贴壁生长。
2.2.2 菌丝生长速度
由表2可以得知，随着培养时间的增加，4种培养基上松乳菇菌丝开始萌发、生长，在20～25 d前菌丝生长较快、菌落直径不断增大;25～30 d后菌丝生长变缓慢、菌落直径增幅变化不大。其中，菌丝在JM培养基上生长速度最快，菌落直径最大，在第35天时菌落直径达到最大值31.90 mm;其次是在SXG和PDA培养基上，第30天时菌落直径分别达到8.41 mm和6.53 mm;而在SXZ培养基上，第25天时菌落直径只有4.96 mm，之后菌丝停止生长。 3 讨论
通过比较不同部位组织分离法和不同培养基对松乳菇分离及菌丝培养产生的影响，结果表明，在进行松乳菇组织分离时，选取松乳菇菌柄和菌肉交界處的组织块更有利于菌种分离成功;选择以酵母浸出粉作为氮源的JM培养基有利于松乳菇菌丝快速生长;在PDA中添加干松针浸出液有利于菌丝形成;但在PDA中添加鲜松针浸出液则不利于菌丝生长，甚至会产生抑制作用。
参考文献：
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[ 4 ] Alexis Guerin-Laguette，Nicholas Cummings，Ruth CatherineButler，et al.Lactarius deliciosus and Pinus radiata in NewZealand： towards the development of innovative gourmetmushroom orchards[J].Mycorrhiza，2014，24（7）： 511-523.
[ 5 ] Guerin-Laguette A，Plassard C，Mousain D.Effects of experi-mental conditions on mycorrhizal relationships betweenPinus sylvestris and Lactarius deliciosus and unprecedentedfruit-body formation of the Saffron milk cap under controlledconditions[J].Canandian Journal of Microbiology，2000，46（9）：790-799.
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[ 7 ] 罗晓蔓，周书宇，杨雪.植物根系分泌物的分类和作用[J].安徽农业科学，2019，47（4）：37-39.
[ 8 ] 刘军，温学森，郎爱东.植物根系分泌物成分及其作用的研究进展[J].食品与安全，2007，9（3A）：63-65.