【摘 要】
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目的 构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,研究其在小鼠睾丸支持细胞(TM4)中的表达及对细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响.方法 应用RT-PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2,利用BamH I和EcoR
【机 构】
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中日友好医院男科,中国铁道建筑总公司北京铁建医院外科,Department of Medicine/Gerontology,国家安全生产监督管理总局煤炭总医院泌尿外科
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目的 构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,研究其在小鼠睾丸支持细胞(TM4)中的表达及对细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响.方法 应用RT-PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点将Cox7a2克隆到pEYFP-C1载体,经酶切、测序及蛋白印迹等技术进行鉴定,并将重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2转染TM4细胞后6、12、24、48 h,采用分光光度计测定COX活性.结果从TM4细胞克隆到Cox7a2基因完整的编码序列,大小为252 bp.构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,转染TM4细胞的效率达70%,融合蛋白表达产物相对分子质量为37 000.重组质粒转染后6、12、24、48 h时COX活性分别为(0.642±0.051)、(0.542±0.049)、(0.311±0.021)和(0.216±0.010)U/mg,不转染组和转染空载体组分别为(0.714±0.064)、(0.653±0.031)U/mg.与不转染组相比,重组质粒转染后12、24、48 h组COX活性显著降低(P＜0.05).结论重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2 载体成功构建.Cox7a2基因对TM4细胞COX活性具有抑制作用,可能对调控COX活性发挥重要作用.
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