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摘要：目的 探讨平痫颗粒在阻抗癫痫形成中对大鼠海马区神经元细胞凋亡影响的分子生物学机制。方法 60只45日龄Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组及平痫小、大剂量组。除正常对照组外，其余各组大鼠均以戊四唑亚惊厥剂量35 mg/kg腹腔注射诱导癫痫模型。同时平痫大、小剂量组以1.66、0.42 g/mL原药材含量2 mL/d灌胃，阳性对照组给予等量的3.6 mg/mL苯巴比妥混悬液灌胃，模型组、正常对照组胃饲等量双蒸水，持续5周。HE染色观察海马神经元细胞病理形态学改变，免疫组化染色（SABC法）观测bcl-2、bax蛋白阳性细胞的表达。结果 给大鼠连续注射戊四唑过程中，模型组大鼠1～4周逐渐出现Ⅰ～Ⅵ级癫痫发作。各治疗组发作次数和级别明显降低，最高为Ⅳ级，组间发作级别、次数相比差异无统计学意义。HE染色显示，各治疗组海马神经元细胞病理表现改善明显。第3、5周末模型组bcl-2表达明显低于正常对照组（P<0.01），bax表达明显高于正常对照组（P<0.01）；各治疗组bcl-2表达均明显高于模型组（P<0.01），bax表达均明显低于模型组（P<0.01）。结论 平痫颗粒可能是通过促进bcl-2蛋白并抑制bax蛋白的表达，从而减少神经元细胞的凋亡，以达到阻抗癫痫的目的。
关键词：平痫颗粒；癫痫；细胞凋亡；bcl-2蛋白；bax蛋白；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.06.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）06-0035-03
癫痫是由多种原因引起的神经元同步化异常放电所致的突然性、反复性和短暂性的运动、感觉、意识、精神和植物神经等功能异常的脑部疾病。研究表明，持续而频繁的癫痫发作可以导致大脑神经元细胞的凋亡，而凋亡的发生与凋亡调控基因bcl-2、bax的表达密切相关[1]。因此，本课题通过动态观察大鼠大脑海马区神经元细胞凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白的表达，从细胞凋亡的角度探讨平痫颗粒阻抗癫痫的效应及其作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
60只45日龄清洁级Wistar大鼠，体质量（120±20）g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2001-0001-0001084。
1.2 药物
戊四唑（PTZ）购自美国Sigma公司，用前以生理盐水配制成溶液，浓度为8.4 mg/mL，批号P6500-1G；平痫颗粒由胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等组成，药材购自兰州市复兴厚药材公司（经鉴定后使用），各药混合后经乙醇提纯浓缩制成低剂量组为0.42 g/mL、高剂量组为1.66 g/mL原药材含量的提取液，置4 ℃冰箱备用；苯巴比妥（批号100525），购自上海化学试剂公司，用5 g/L羟丙基甲基纤维素、1 g/L吐温80及双蒸水配成3.6 mg/mL混悬液。
1.3 试剂及仪器
即用型SABC免疫组化试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司，产品编号SA1022，包括以下试剂：①一抗，即bcl-2多克隆抗体和bax多克隆抗体；②生物素化山羊抗兔IgG；③抗原修复液Ⅰ（微波修复法中用）；④复合消化液；⑤5%BSA封闭液；⑥试剂SABC。光学显微镜：日本OLYMOUS，型号CX21；显微照相系统：山东易创MiE图像处理系统软件；多媒体彩色病理图像分析系统：BI-2000图像分析系统。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠适应性饲养3 d后，按随机数字表法分为正常对照组、模型组、阳性对照组及平痫小、大剂量组，每组12只。
2.2 造模
除正常对照组外，其余4组参考文献[2]方法制备癫痫模型。均以戊四唑亚惊厥剂量35 mg/kg腹腔注射，1次/d，持续4周。停药1周后第5周末，再次用相同剂量戊四唑进行末次点燃测试，凡显示连续5次以上Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥者为达到点燃标准，Ⅳ～Ⅵ级的痫性行为被视为充分点燃。大鼠惊厥发作依据七点评分法[2]评判。正常对照组给予相同剂量的生理盐水。
2.3 饲药
造模同时除正常对照组和模型组外，其余各组灌服药物。平痫大、小剂量组分别灌服平痫颗粒2 mL，灌胃剂量按70 kg质量成人量每日给中药剂量为97 g，折算成大鼠等效剂量，原药材含量分别为1.66、0.42 g/mL，相当于42 kg体质量成年人临床用量的12、3倍；阳性对照组灌服等量苯巴比妥；正常对照组和模型组灌服等量生理盐水。每日灌胃1次，连续5周。
2.4 取材
在第3、5周末对大鼠分2批进行取材。各组大鼠在相同条件下用乙醚吸入麻醉，经升主动脉先后灌入生理盐水和含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，待大鼠全身僵硬后，迅速开颅取脑，修整后的脑组织块置于上述滴注液内4 ℃过夜，再置于200 g/L蔗糖中12 h。每个大脑半球于背侧海马最大断面处切取3 mm厚的组织，制成石蜡包块，再做冠状切片，厚度为4 ?m。
2.5 HE染色
石蜡切片经常规脱蜡入水后，在苏木素溶液浸染10 min；1%盐酸酒精分色3～5 s（当深蓝紫色变为淡粉红色则中止）；氨水反蓝5 min（由淡粉红色变为淡蓝色），自来水冲洗，终止反应。镜下观察，细胞核清晰染色呈蓝紫色，细胞浆及其他背景基本无色即可。伊红溶液染色5 min，自来水冲洗；镜下观察，细胞浆呈红色，胞核蓝色即可。随后经梯度乙醇（从低浓度到高浓度）脱水，每次2 min；二甲苯透明2次，每次10 min；最后用中性树胶封片。
2.6 免疫组化染色
石蜡切片常规脱蜡至水，再放入H2O2稀释液中室温10 min；滴加复合消化液8 min；滴加5%BSA封闭液20 min；以1∶100的比例用蒸馏水将一抗bcl-2、bax稀释后，滴加在切片组织上，4 ℃冰箱过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG，孵育20 min；再滴加试剂SABC，孵育20 min；DAB显色；苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水反蓝，梯度酒精脱水；用中性树胶封片，晾干即可。 2.7 图像分析
用BI-2000多媒体彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，并采用山东易创MiE图像处理系统进行显微照相，所有切片放大倍数均为40倍，观测大鼠在癫痫形成不同时间段海马区凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白表达程度，每部位取2个视野，测量同一视野的平均光密度、平均灰度，并分别取其平均数进行统计学分析。
2.8 主要观察指标
①各组大鼠在癫痫形成不同时间段惊厥行为的变化。②各组大鼠在癫痫形成不同时间段海马神经元细胞病理改变。③各组大鼠在癫痫形成不同时间段海马区凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白表达的变化。
3 统计学方法
结果用SPSS15.0统计软件进行统计学处理。采用方差分析，进行组间两两比较，实验数据以—x±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 各组大鼠行为学观察结果
每日观察并记录注射戊四唑后1 h内大鼠的行为变化。在连续注射过程中，大鼠逐渐出现凝视、点头、面部及颈部抽搐、全身肌阵挛以及喉间发出异常叫声。模型组大鼠1周后逐渐出现癫痫发作，级别Ⅰ～Ⅱ级，发作不明显；随点燃次数增加，癫痫发作逐渐增强，连续注射3周时大鼠出现Ⅱ～Ⅳ级惊厥，连续注射4周时出现Ⅵ级大发作。阳性对照组及平痫大、小剂量组发作次数和级别明显降低，最高级别为Ⅳ级，且2组间发作级别、次数相比差异无统计学意义。
4.2 各组大鼠海马区神经元细胞的病理改变
经HE染色观察海马组织病理学改变，正常对照组神经元结构正常，细胞核圆而规则，核膜清楚，有明显的核仁，仅少量锥体细胞核染色质浓缩，核膜境界不清。模型组大量锥体细胞核不规则并固缩深染，胞浆嗜伊红，细胞间隙明显增大，胞浆呈空泡样变，正常神经元数量显著减少，并且随戊四唑点燃次数的增加，神经元凋亡显著增多。阳性对照组、平痫小剂量组、平痫大剂量组神经元细胞核固缩、深染、异变及胞浆异染的病理变化减轻，正常结构的神经元较多，且平痫大剂量组的神经元病理变化改善更为明显。
4.3 平痫颗粒对癫痫大鼠海马区bcl-2、bax表达的影响（见表1、表2）
5 讨论
细胞凋亡又名程序性死亡（programmed cell death，PCD），它不仅仅是一种自身保护性机制，还可能与许多神经系统病理状态，诸如肿瘤、缺血及神经退行性疾病的发病机制密切相关。有关研究表明，癫痫与细胞凋亡密切相关。如Pollard等[3]以海人酸（kainic acid，KA）诱导鼠癫痫持续状态（status epilepticus， SE），当向鼠杏仁核区注射KA后，可以观察到杏仁核区神经元细胞凋亡现象；王氏等[4]以腹腔注射美解眠诱导SE，也观察到大鼠海马神经元有细胞凋亡现象。凋亡的发生与凋亡调控基因bcl-2、bax的表达密切相关，根据脑内神经元细胞凋亡相关基因在凋亡过程中所起的作用可分为两大类：一类是促凋亡基因，如bax，bax蛋白作为线粒体膜上离子通道的组成成分，使细胞色素C得以穿过线粒体膜，使caspase-9激活，并进一步激活caspase-3，最终导致细胞凋亡[5]。因此bax在线粒体依赖性凋亡途径中具有重要作用。另一类是抑凋亡基因，如bcl-2。bcl-2蛋白主要分布于线粒体和细胞质中，它主要通过抑制线粒体膜tbid插入、bax转位和bax/bax寡聚化起到抑制凋亡的作用[3]。
平痫颗粒药用胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等，以化痰活血、熄风定痫为根本大法，临床疗效颇为显著[5]。本课题选用PTZ点燃致痫模型，是公认理想的癫痫动物模型，其致痫性增高具有永久的保留能力，并较好地模拟了人类癫痫的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。
本课题通过动态观察不同时段平痫颗粒对大鼠痫性行为的影响，以及通过观测不同时段大鼠大脑海马区神经元细胞凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白的表达，从细胞凋亡学角度推测，平痫颗粒可能是通过促进抗凋亡调控基因bcl-2蛋白的表达，以及抑制促凋亡调控基因bax蛋白的表达，从而减少神经元细胞的凋亡，以达到治疗癫痫的目的。
参考文献：
[1] 欧阳宛炯，林元相，张鹏飞.癫痈灶中凋亡调控基因Bcl-2和Bax的表达[J].中华神经医学杂志，2004，3（6）：425-427.
[2] 徐国龙，杨帆，章复清，等.柴胡加龙骨牡蛎汤对PTZ点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响[J].中国医药学报，2002，17（3）：165-167.
[3] Pollard H， Marksteiner t， Saris a， et al. Kainaet-induced apoptotic cell death[J]. Neuroscience，2001，27（5）：378-379.
[4] 王焕明，谭启富.颞叶癫痫患者脑内细胞凋亡现象的研究[J].中华神经外科杂志，1999，15（6）：333-335.
[5] 田茸，张士卿，史正刚，等.平痫汤治疗癫痫62例疗效观察[J].中国中医药信息杂志，2009，16（6）：69.
（收稿日期：2012-01-09，编辑：华强）
关键词：平痫颗粒；癫痫；细胞凋亡；bcl-2蛋白；bax蛋白；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.06.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）06-0035-03
癫痫是由多种原因引起的神经元同步化异常放电所致的突然性、反复性和短暂性的运动、感觉、意识、精神和植物神经等功能异常的脑部疾病。研究表明，持续而频繁的癫痫发作可以导致大脑神经元细胞的凋亡，而凋亡的发生与凋亡调控基因bcl-2、bax的表达密切相关[1]。因此，本课题通过动态观察大鼠大脑海马区神经元细胞凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白的表达，从细胞凋亡的角度探讨平痫颗粒阻抗癫痫的效应及其作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
60只45日龄清洁级Wistar大鼠，体质量（120±20）g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2001-0001-0001084。
1.2 药物
戊四唑（PTZ）购自美国Sigma公司，用前以生理盐水配制成溶液，浓度为8.4 mg/mL，批号P6500-1G；平痫颗粒由胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等组成，药材购自兰州市复兴厚药材公司（经鉴定后使用），各药混合后经乙醇提纯浓缩制成低剂量组为0.42 g/mL、高剂量组为1.66 g/mL原药材含量的提取液，置4 ℃冰箱备用；苯巴比妥（批号100525），购自上海化学试剂公司，用5 g/L羟丙基甲基纤维素、1 g/L吐温80及双蒸水配成3.6 mg/mL混悬液。
1.3 试剂及仪器
即用型SABC免疫组化试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司，产品编号SA1022，包括以下试剂：①一抗，即bcl-2多克隆抗体和bax多克隆抗体；②生物素化山羊抗兔IgG；③抗原修复液Ⅰ（微波修复法中用）；④复合消化液；⑤5%BSA封闭液；⑥试剂SABC。光学显微镜：日本OLYMOUS，型号CX21；显微照相系统：山东易创MiE图像处理系统软件；多媒体彩色病理图像分析系统：BI-2000图像分析系统。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠适应性饲养3 d后，按随机数字表法分为正常对照组、模型组、阳性对照组及平痫小、大剂量组，每组12只。
2.2 造模
除正常对照组外，其余4组参考文献[2]方法制备癫痫模型。均以戊四唑亚惊厥剂量35 mg/kg腹腔注射，1次/d，持续4周。停药1周后第5周末，再次用相同剂量戊四唑进行末次点燃测试，凡显示连续5次以上Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥者为达到点燃标准，Ⅳ～Ⅵ级的痫性行为被视为充分点燃。大鼠惊厥发作依据七点评分法[2]评判。正常对照组给予相同剂量的生理盐水。
2.3 饲药
造模同时除正常对照组和模型组外，其余各组灌服药物。平痫大、小剂量组分别灌服平痫颗粒2 mL，灌胃剂量按70 kg质量成人量每日给中药剂量为97 g，折算成大鼠等效剂量，原药材含量分别为1.66、0.42 g/mL，相当于42 kg体质量成年人临床用量的12、3倍；阳性对照组灌服等量苯巴比妥；正常对照组和模型组灌服等量生理盐水。每日灌胃1次，连续5周。
2.4 取材
在第3、5周末对大鼠分2批进行取材。各组大鼠在相同条件下用乙醚吸入麻醉，经升主动脉先后灌入生理盐水和含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，待大鼠全身僵硬后，迅速开颅取脑，修整后的脑组织块置于上述滴注液内4 ℃过夜，再置于200 g/L蔗糖中12 h。每个大脑半球于背侧海马最大断面处切取3 mm厚的组织，制成石蜡包块，再做冠状切片，厚度为4 ?m。
2.5 HE染色
石蜡切片经常规脱蜡入水后，在苏木素溶液浸染10 min；1%盐酸酒精分色3～5 s（当深蓝紫色变为淡粉红色则中止）；氨水反蓝5 min（由淡粉红色变为淡蓝色），自来水冲洗，终止反应。镜下观察，细胞核清晰染色呈蓝紫色，细胞浆及其他背景基本无色即可。伊红溶液染色5 min，自来水冲洗；镜下观察，细胞浆呈红色，胞核蓝色即可。随后经梯度乙醇（从低浓度到高浓度）脱水，每次2 min；二甲苯透明2次，每次10 min；最后用中性树胶封片。
2.6 免疫组化染色
石蜡切片常规脱蜡至水，再放入H2O2稀释液中室温10 min；滴加复合消化液8 min；滴加5%BSA封闭液20 min；以1∶100的比例用蒸馏水将一抗bcl-2、bax稀释后，滴加在切片组织上，4 ℃冰箱过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG，孵育20 min；再滴加试剂SABC，孵育20 min；DAB显色；苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水反蓝，梯度酒精脱水；用中性树胶封片，晾干即可。 2.7 图像分析
用BI-2000多媒体彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，并采用山东易创MiE图像处理系统进行显微照相，所有切片放大倍数均为40倍，观测大鼠在癫痫形成不同时间段海马区凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白表达程度，每部位取2个视野，测量同一视野的平均光密度、平均灰度，并分别取其平均数进行统计学分析。
2.8 主要观察指标
①各组大鼠在癫痫形成不同时间段惊厥行为的变化。②各组大鼠在癫痫形成不同时间段海马神经元细胞病理改变。③各组大鼠在癫痫形成不同时间段海马区凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白表达的变化。
3 统计学方法
结果用SPSS15.0统计软件进行统计学处理。采用方差分析，进行组间两两比较，实验数据以—x±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 各组大鼠行为学观察结果
每日观察并记录注射戊四唑后1 h内大鼠的行为变化。在连续注射过程中，大鼠逐渐出现凝视、点头、面部及颈部抽搐、全身肌阵挛以及喉间发出异常叫声。模型组大鼠1周后逐渐出现癫痫发作，级别Ⅰ～Ⅱ级，发作不明显；随点燃次数增加，癫痫发作逐渐增强，连续注射3周时大鼠出现Ⅱ～Ⅳ级惊厥，连续注射4周时出现Ⅵ级大发作。阳性对照组及平痫大、小剂量组发作次数和级别明显降低，最高级别为Ⅳ级，且2组间发作级别、次数相比差异无统计学意义。
4.2 各组大鼠海马区神经元细胞的病理改变
经HE染色观察海马组织病理学改变，正常对照组神经元结构正常，细胞核圆而规则，核膜清楚，有明显的核仁，仅少量锥体细胞核染色质浓缩，核膜境界不清。模型组大量锥体细胞核不规则并固缩深染，胞浆嗜伊红，细胞间隙明显增大，胞浆呈空泡样变，正常神经元数量显著减少，并且随戊四唑点燃次数的增加，神经元凋亡显著增多。阳性对照组、平痫小剂量组、平痫大剂量组神经元细胞核固缩、深染、异变及胞浆异染的病理变化减轻，正常结构的神经元较多，且平痫大剂量组的神经元病理变化改善更为明显。
4.3 平痫颗粒对癫痫大鼠海马区bcl-2、bax表达的影响（见表1、表2）
5 讨论
细胞凋亡又名程序性死亡（programmed cell death，PCD），它不仅仅是一种自身保护性机制，还可能与许多神经系统病理状态，诸如肿瘤、缺血及神经退行性疾病的发病机制密切相关。有关研究表明，癫痫与细胞凋亡密切相关。如Pollard等[3]以海人酸（kainic acid，KA）诱导鼠癫痫持续状态（status epilepticus， SE），当向鼠杏仁核区注射KA后，可以观察到杏仁核区神经元细胞凋亡现象；王氏等[4]以腹腔注射美解眠诱导SE，也观察到大鼠海马神经元有细胞凋亡现象。凋亡的发生与凋亡调控基因bcl-2、bax的表达密切相关，根据脑内神经元细胞凋亡相关基因在凋亡过程中所起的作用可分为两大类：一类是促凋亡基因，如bax，bax蛋白作为线粒体膜上离子通道的组成成分，使细胞色素C得以穿过线粒体膜，使caspase-9激活，并进一步激活caspase-3，最终导致细胞凋亡[5]。因此bax在线粒体依赖性凋亡途径中具有重要作用。另一类是抑凋亡基因，如bcl-2。bcl-2蛋白主要分布于线粒体和细胞质中，它主要通过抑制线粒体膜tbid插入、bax转位和bax/bax寡聚化起到抑制凋亡的作用[3]。
平痫颗粒药用胆南星、白僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等，以化痰活血、熄风定痫为根本大法，临床疗效颇为显著[5]。本课题选用PTZ点燃致痫模型，是公认理想的癫痫动物模型，其致痫性增高具有永久的保留能力，并较好地模拟了人类癫痫的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。
本课题通过动态观察不同时段平痫颗粒对大鼠痫性行为的影响，以及通过观测不同时段大鼠大脑海马区神经元细胞凋亡调控基因bcl-2、bax蛋白的表达，从细胞凋亡学角度推测，平痫颗粒可能是通过促进抗凋亡调控基因bcl-2蛋白的表达，以及抑制促凋亡调控基因bax蛋白的表达，从而减少神经元细胞的凋亡，以达到治疗癫痫的目的。
参考文献：
[1] 欧阳宛炯，林元相，张鹏飞.癫痈灶中凋亡调控基因Bcl-2和Bax的表达[J].中华神经医学杂志，2004，3（6）：425-427.
[2] 徐国龙，杨帆，章复清，等.柴胡加龙骨牡蛎汤对PTZ点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响[J].中国医药学报，2002，17（3）：165-167.
[3] Pollard H， Marksteiner t， Saris a， et al. Kainaet-induced apoptotic cell death[J]. Neuroscience，2001，27（5）：378-379.
[4] 王焕明，谭启富.颞叶癫痫患者脑内细胞凋亡现象的研究[J].中华神经外科杂志，1999，15（6）：333-335.
[5] 田茸，张士卿，史正刚，等.平痫汤治疗癫痫62例疗效观察[J].中国中医药信息杂志，2009，16（6）：69.
（收稿日期：2012-01-09，编辑：华强）