论文部分内容阅读
摘要：旨在明确助剂激健（主要成分为非离子表面活性剂、油酸甲酯、玉米胚芽油、油茶籽油等）对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草是否具有增效作用，并探究其最佳增效剂量及机制。采用室内整株生物测定法筛选激健对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草的最佳增效剂量，并通过测定激健对药液表面张力、接触角、扩展直径、最大持留量等物理指标的影响，以及对抗精唑禾草灵菵草乙酰乳酸合酶（ALS）活性的影响，来阐明其增效作用机制。结果表明，助剂激健和甲基二磺隆的最佳增效组合为甲基二磺隆12 g a.i./hm2+激健0.05%（体积分数）;激健能显著降低药液的表面张力及接触角，显著增加扩展直径及最大持留量;激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性无显著影响。由结果可以看出，助剂激健对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草具有增效作用，主要是通过改变药液理化性质而发挥增效作用，而不是在生理生化水平上对甲基二磺隆的靶标酶活性产生影响。
关键词：菵草;精唑禾草灵抗性;助剂激健;整株生物测定;小麦安全性;增效机制
中图分类号：S451.2 文献标志码：A 文章编号：1003-935X（2019）01-0056-08
Abstract：This study aims to clarify whether the adjuvant Jijian （whose main ingredients are non-ionic surfactant，methyloleate，corn germ oil，Camellia oleifera seed oil） has a synergistic effect on mesosulfuron-methyl for the control of fenoxaprop-P-ethyl-resistant Beckmannia syzigachne，andto determine the best synergistic dose and mechanism.Whole-plant bioassayswere used to screen the best synergistic dose of adjuvant Jijian;thesynergism mechanism was explored by testing the influence of Jijian on physical indexes such as surface tension，contactangle，expanded diameter and maximum retention of the pesticide liquid. The effect Jijian to ALS enzyme activity in fenoxaprop-P-ethyl-resistant B.syzigachnewas also tested. The best combination dose was mesosulfuron-methyl 12 g a.i./hm2+Jinjian 0.05% （V/V）. Jijian significantly reduced the surface tension and contact angle of the pesticide liquid while increasing the expanded diameter and the maximum retention. Jijianhad no significant effect on the ALS enzyme activity of fenoxaprop-P-ethyl-resistant B.syzigachne. Jijianhad a synergistic effect on mesosulfuron-methyl in controllingfenoxaprop-P-ethyl-resistant B.syzigachne. The synergistic effect was exerted mainly by changing the physicochemical properties of the herbicide liquid，with no affect on the activity of the target enzyme at the physiological and biochemical level.
Key words：Beckmannia syzigachne;fenoxaprop-P-ethyl-resistant;adjuvant;whole plant bioassay;safety to wheat;synergistic mechanism
精唑禾草靈为芳氧基苯氧基丙酸酯类（AOPPs）除草剂，其作用靶标为乙酰辅酶A羧化酶（ACCase），因其活性高、杀草谱广而被广泛用于小麦田防除一年生禾本科杂草。由于长期单一使用该除草剂，并逐年增加用量，从而导致其药效下降。张锁荣发现，菵草在连续多年使用精唑禾草灵后已对其产生了抗药性[1]。笔者所在实验室的潘浪等通过环介导等温扩增（LAMP）和衍生酶切扩增多态性（dCAPS）方法检测发现，抗精唑禾草灵菵草存在I1781L、W2027C、I2041A、D2078G及G2096A等5种不同类型的突变，并且不同ACCase突变类型的菵草与其对精唑禾草灵的抗性程度之间存在一定关系，即相对抗性倍数越高的菵草种群，其纯合突变的频率也越高;同时，确定了不同突变位点对烯草酮、唑啉草酯、高效氟吡甲禾灵、炔草酸等AOPPs类除草剂不同水平的交互抗性[2]。除靶标抗性外，菵草对精唑禾草灵还存在非靶标抗性，潘浪等研究发现，用胡椒基丁醚（PBO）或1-氨基苯并三唑（ABT）预处理，可以不同程度地提高精唑禾草灵对抗性菵草的抑制作用，这表明细胞色素P450系统在菵草对精唑禾草灵的抗性中起着一定程度的作用[3]。由于菵草对ACCase抑制剂类除草剂的交互抗性及代谢抗性问题日渐严重，在正常田间推荐剂量下，精唑禾草灵、炔草酯、唑啉草酯等小麦田常用除草剂已经不能对其进行有效的防除。 甲基二磺隆（mesosulfuron-methyl）为磺酰脲类除草剂，其作用靶标为乙酰乳酸合酶（ALS）。在小麦田杂草对精唑禾草灵抗药性日益严重的情况下，甲基二磺隆逐渐成为治理麦田恶性杂草的有效除草剂品种之一[4-5]。但是由于甲基二磺隆对施药技术要求较高，施药剂量过大而引起的药害现象时有发生。因此，在不降低其田间防除效果的前提下，找到一种能够减少除草剂用量，同时对小麦安全的除草剂助剂是一种理想的解决办法。
作为除草剂助剂的表面活性剂有非离子型、阳离子型和阴离子型。其中非离子型表面活性剂的通用性较强，是除草剂中应用最广泛的一种助剂[6]。激健（主要成分为非离子表面活性剂、油酸甲酯、玉米胚芽油、油茶籽油等）是多元醇类非离子表面活性剂，它与农药混用，可以增强农药的渗透性和传导性，减少农药的使用量[7]，同时对作物、人畜、环境安全[8]。研究表明，激健在农药防治棉叶螨、茶尺蠖、小绿叶蝉、葡萄霜霉病等病虫害中表现出较好的增效减量作用，但在田间杂草防治过程中的报道较少[9-13]。本研究以兼具细胞色素P450氧化酶系代谢抗性的G2096A位点突变的抗精唑禾草灵菵草、助剂激健及甲基二磺隆为试验材料，旨在明确激健对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草的增效作用，确定激健的最佳增效剂量，找到激健与甲基二磺隆的最佳剂量组合，验证其对小麦的安全性，并在物理性状层面及抗精唑禾草灵菵草ALS活性上初步阐明其增效减量作用机制，为小麦田抗精唑禾草灵菵草的治理及除草剂的减量使用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
抗精唑禾草灵菵草种子于2014年5月采自江苏省扬州市江都区。其对精唑禾草灵的GR50值（使杂草生物量降低50%的除草剂剂量）为 1 324.75 g a.i./hm2，相对抗性倍数为31.05，抗性机制为靶标抗性以及代谢抗性，靶标位点为G2096A突变，代谢抗性机制为细胞色素P450氧化酶系代谢的加强[3]。小麦种子品种为镇麦6号，2016年6月由阜宁县农业科学研究所提供。
将采集的菵草种子清洁晾干后装入尼龙网袋内，室外埋土1个月解除休眠，取出后于室内晾干并装入纸袋内，与小麦种子一同置于4 ℃冷藏冰箱内储藏，备用。
1.2 供试药剂与助剂
供试药剂及喷施剂量见表1。
1.3 试验方法
1.3.1 激健最佳增效剂量的筛选 采用室内整株生物测定法测定[14-15]。在规格为7 cm×7 cm×7 cm 的塑料杯中装入未使用过除草剂的有机土，pH值为6.7，有机质含量为1.59%，加水至饱和。选择籽粒饱满的抗精唑禾草灵的菵草种子，在每个塑料杯中播种20粒，然后再覆1层细土，放入温室中生长，其温度设置为光照时20 ℃，黑暗时15 ℃，光—暗周期为12 h—12 h，抗精唑禾草灵菵草出苗后定苗至15株，待抗精唑禾草灵菵草长至3～5叶期，采用茎叶喷雾处理法对其进行药剂处理，对照喷施等量清水，每个处理重复4次。助剂激健的推荐剂量为0.05%，设置助剂剂量为0、0.03%、0.04%、0.05%和0.06%（均为体积分数，下同），30g/L甲基二磺隆油悬浮剂剂量设置为推荐剂量的60%，即8 g a.i./hm2，激健各处理与甲基二磺隆设置剂量混合。喷雾采用农业农村部南京农业机械化研究所生产的3WP-2000型行走式生测喷雾塔，主轴转动速度为96 mm/r，喷雾高度为300 mm，喷头有效喷幅为350 mm，喷头流量为390 mL/min，行走距离为1 340 mm，药液体积为30 mL。待药剂晾干后，放入温室内培养，施药后14 d剪下各处理抗精唑禾草灵菵草地上部分，称鲜重，计算鲜重抑制率。
1.3.2 激健对甲基二磺隆增效减量剂量的测定 采用室内整株生物测定法测定[14-15]。在每个塑料杯中播种20粒抗精唑禾草灵菵草种子，土壤和培养条件同“1.3.1”节，待抗精唑禾草灵菵草长至3～5叶期，采取茎叶喷雾处理法对其进行药剂处理，对照喷施等量清水，每个处理重复4次。30 g/L甲基二磺隆油悬浮剂剂量设置为0、8、12、16 g a.i./hm2，各药剂处理加入0.05%激健，以甲基二磺隆单剂作为对照。茎叶喷雾处理方法同“1.3.1”节，待药剂晾干后，放入温室内培养，施药后14 d剪下各处理抗精唑禾草灵菵草地上部分，称鲜重，计算鲜重抑制率。
1.3.3 激健对小麦安全性的测定 采用室内整株生物测定法测定[14-15]。在每个塑料杯中播种10粒小麦种子，土壤和培养条件同“1.3.1”节，小麦出苗后定苗至8株，药剂剂量设置及喷雾处理方法同“1.3.1”节及“1.3.2”节。待药剂晾干后，放入温室内培养，施药后15 d剪下各处理小麦地上部分，称鲜重，计算鲜重抑制率，比较各处理之間小麦的鲜重差异显著性。
鲜重抑制率的计算公式如下：
鲜重抑制率=（对照鲜重-处理鲜重）/对照鲜重×100%。
1.3.4 激健对甲基二磺隆药液物理性状的影响测定 将激健按照0.05%的体积分数加入 8 g a.i./hm2 甲基二磺隆药液中，测定蒸馏水（对照CK）、0.05%激健（处理1）、8 g a.i./hm2甲基二磺隆（处理2）及0.05%激健+8 g a.i./hm2甲基二磺隆（处理3）4种样品的表面张力、接触角、扩展直径及最大持留量等物理性状指标。
1.3.4.1 激健对甲基二磺隆药液表面张力的影响测定 分别取各处理待测液，用自动界面张力仪测定其表面张力，记录数值，每个处理设4个重复。
1.3.4.2 激健对甲基二磺隆药液接触角的影响测定 分别取各处理待测液，利用接触角测量仪测定上述药液的接触角，记录数值，每个处理设4个重复。
1.3.4.3 激健对甲基二磺隆药液扩展直径的影响测定 参照卢向阳等的测定方法[16]，用移液枪吸取各处理溶液2.5 μL滴在石蜡玻片表面，置于双筒解剖镜下观察，待液滴充分扩展后，干燥前用测微尺测量液滴的最大直径、最小直径，将二者均值作为液滴直径。记录数值，每个处理设4个重复。 1.3.4.4 激健对甲基二磺隆药液最大持留量的影响测定 采用浸渍法[17]，剪取抗精唑禾草灵菵草的叶片称质量（m0），然后将其垂直浸入药液中保持3 s，迅速将叶片拉出液面，垂直悬置，待其不再有液滴流淌时称质量（m1），用叶面积仪测定叶片的面积（S），计算叶片对药液的最大持留量Rm。记录数值，每个处理设4个重复。计算公式：Rm=（m1-m0）/S。
1.3.5 激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性的影响测定 采用测定粗酶液的方法测定抗精唑禾草灵菵草离体ALS活性，参照Yu等的方法[18]并略作修改。剪取3 g 3～4叶期抗精唑禾草灵菵草叶片，剪碎后放入液氮中迅速研磨成粉，待液氮挥发后，加入6 mL酶提取液[含有5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP（焦磷酸硫胺素）、0.1 mol/L FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）、含10 mmol/L丙酮酸钠的pH值=7.0的磷酸缓冲液]，用2层尼龙纱网过滤到预冷的离心管中，获得粗酶液，以上步骤均在 0～4 ℃条件下进行。将粗酶液在4 ℃、27 000 g 条件下离心15 min，小心移取上清液，置于干净的离心管中。取1.5 mL离心管若干，分别加入100 μL酶反应液（含有5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L TPP、0.1 mol/L FAD、含100 mmol/L丙酮酸钠的pH值=7.0的磷酸缓冲液）、100 μL酶液，再分别加入0.05%激健（处理1）、0.1 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理2）、0.05%激健+0.1 μmol/L 甲基二磺隆原药溶液（处理3）、1 μmol/L 甲基二磺隆原药溶液（处理4）、0.05%激健+1 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理5）、10 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理6）、0.05%激健+10 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理7）各100 μL，设蒸馏水为对照（CK）。将反应液摇匀后置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min，向每个试管中加入40 μL 6 mol/L H2SO4终止反应;将反应试管置于60 ℃水浴中保溫15 min，向每支离心管中分别加入现配制的0.5%肌酸和5%1-萘酚（溶于2.5 mol/L NaOH溶液）各200 μL，60 ℃水浴保温15 min，冷却至室温后，从每支反应试管中取出200 μL反应溶液加入到96孔酶标板中，测定D530 nm。每个药剂处理设3个重复。
1.4 数据处理
用Excel、DPS v15.10等软件进行数据处理及差异显著性分析，多重比较采用Duncans 法。
2 结果与分析
2.1 激健最佳增效剂量
由表2可知，在助剂剂量设置范围内，随着助剂剂量的提高，添加激健的甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率逐渐提升，表明激健对甲基二磺隆有增效作用。由鲜重抑制率的差异显著性分析可以看出，添加激健剂量为0.05%时的鲜重抑制率显著高于添加激健剂量为0.03%、0.04%的处理，而与添加激健剂量为0.06%时无显著差异，由此可见， 随着激健剂量的提高，甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率逐渐提高，当激健剂量达到0.05%时，随着激健剂量的提升，鲜重抑制率无显著变化，因此，激健的最佳增效剂量为0.05%。
2.2 激健对甲基二磺隆的增效剂量
由表3可知，在甲基二磺隆剂量设置范围内，添加激健的甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率提高了2.60～7.94百分点。当甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率为90%时，甲基二磺隆的用量略大于 16 g a.i./hm2，添加激健后，甲基二磺隆的用量略小于 12 g a.i./hm2，二者相比，甲基二磺隆的用量减少了25%以上。由此可见，激健的加入能够在一定程度上减少甲基二磺隆的用量。
2.3 激健对小麦安全性的测定
由表4可知，在激健与甲基二磺隆剂量设置范围内，添加激健的甲基二磺隆在不同助剂剂量下以及不同药剂剂量下，各鲜重之间均无显著差异，药后观察无药害发生，这表明激健对小麦安全。
2.4 激健对甲基二磺隆药液物理性状的影响
与蒸馏水对照相比，激健能够显著降低蒸馏水以及甲基二磺隆药液样品的表面张力（图1）。蒸馏水的表面张力为72.44 mN/m，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液表面张力均显著低于蒸馏水对照，分别为20.70、21.34 mN/m;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，其表面张力显著降低，为 18.17 mN/m，显著低于蒸馏水对照、甲基二磺隆单剂处理。
与蒸馏水对照相比，激健能够显著降低蒸馏水及甲基二磺隆药液样品的接触角（图2）。蒸馏水与抗精唑禾草灵菵草叶面的接触角为116.88°，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液与抗精唑禾草灵菵草叶面的接触角分别为72.63°、74.75°;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，与抗精唑禾草灵菵草叶面的接触角为65.38°，显著低于蒸馏水对照和甲基二磺隆单剂处理。
与蒸馏水对照相比，激健能够显著增大蒸馏水以及甲基二磺隆药液样品的扩展直径（图3）。蒸馏水的扩展直径为3.70 mm，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液的扩展直径分别为4.60、4.54 mm;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，其扩展直径为5.01 mm，显著高于蒸馏水对照和甲基二磺隆单剂。
与蒸馏水对照相比，激健能够显著增大蒸馏水及甲基二磺隆药液样品的最大持留量（图4）。蒸馏水的最大持留量为0.75 mg/cm2，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液的最大持留量分别为9.85、10.15 mg/cm2;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，其最大持留量为12.50 mg/cm2，显著高于蒸馏水对照和甲基二磺隆单剂。由于激健对样品物理性状的改变，增加了药液的润湿展布性能，从而有助于发挥其增效减量的作用。 2.5 激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性的影响
由图5可知，处理1与CK、处理2与处理3、处理4与处理5、处理6与处理7之间在乙酰乳酸合酶活性上均无显著差异，表明激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性无明显影响，激健的加入不能影响甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的ALS活性。
3 讨论与结论
随着菵草对精唑禾草灵以及小麦田其他常用ACCase抑制剂类除草剂如唑啉草酯、炔草酯等药剂的交互抗性问题日渐严重[19-21]，给小麦田抗药性菵草的防除带来了极大的挑战。而小麦田菵草对以甲基二磺隆为主的ALS抑制类除草剂的抗性发生程度较低[20]，因此，甲基二磺隆仍可用于小麦田抗精唑禾草灵菵草的防除。但是甲基二磺隆在田间过量使用时，极易产生药害问题，因此可以通过添加助剂提高其防除效果，减少其有效成分用量，可以在一定程度上解决药害问题，同时可以延缓甲基二磺隆抗性的发生。
本研究确定了激健对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草具有增效作用，其最佳增效剂量为0.05%。在12 g a.i./hm2甲基二磺隆+0.05%激健处理下，其对抗精唑禾草灵菵草的室内毒力效果可以达到90%以上的鲜重抑制率，与甲基二磺隆的最高推荐剂量16 g a.i./hm2相比，其有效成分用量减少了25%。在0.05%激健和8～16 g a.i./hm2 甲基二磺隆范围内，甲基二磺隆和激健在任一剂量搭配时，各处理组小麦鲜重之间均无显著差异，药后观察无药害发生，这表明在以上范围内，激健与甲基二磺隆组合对小麦安全。12 g a.i./hm2甲基二磺隆+0.05%激健的组合，既可有效防除抗精唑禾草灵菵草，又能减少甲基二磺隆的用量，并且对小麦安全。
研究结果表明，激健的加入能够显著降低蒸馏水以及甲基二磺隆药液的表面张力、接触角，显著增大蒸馏水以及甲基二磺隆药液的扩展直径以及最大持留量等理化性质，但是激健并不能影响抗精唑禾草灵菵草的ALS活性。综合这2个因素，说明激健主要通过改变药液在杂草叶片的润湿展布性能，增加或加速杂草对药液的吸收，从而发挥其增效减量作用。这与目前报道的油类助剂增效机制，即延长喷雾雾滴干燥时间、促进药剂吸收和叶面渗透、促进药剂在难以湿润靶标上的黏附和扩散以利于农药吸收等[22-23]是一致的。但激健并不能通过影响抗精唑禾草灵菵草靶标酶的活性发挥其增效作用。至于激健是否有更深层次的增效作用机制，还有待进一步研究及验证。
参考文献：
[1]张锁荣. 苏南地区稻麦连作田菵草对精唑禾草灵的抗药性及控制方法研究[D]. 南京：南京农业大学，2007.
[2]Pan L，Li J，Xia W W，et al. An effective method，composed of LAMP and dCAPS，to detect different mutations in fenoxaprop-P-ethyl-resistant American sloughgrass （Beckmannia syzigachne Steud.） populations[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2015，117：1-8.
[3]Pan L，Li J，Zhang T，et al. Cross-resistance patterns to acetyl coenzyme A carboxylase （ACCase） inhibitors associated with different ACCase mutations in Beckmannia syzigachne[J]. Weed Research，2015，55（6）：609-620.
[4]唐建明. 江蘇麦田恶性禾本科杂草及其适用除草药剂[J]. 杂草科学，2008（3）：75-76.
[5]张敏恒. 磺酰脲类除草剂的发展现状、市场与未来趋势[J]. 农药，2010，49（4）：235-240.
[6]王成菊，张文吉. 助剂在除草剂应用中的作用及发展前景[J]. 农药学学报，2003，5（1）：441-446.
[7]宋朝凤，王洪涛，王英姿. 农药助剂倍创对辛硫磷防治韭菜韭蛆的增效作用[J]. 北方园艺，2015（9）：99-101.
[8]徐建军，何强章. 农药增效助剂倍创的创制与应用研究[J]. 山东农药信息，2010（4）：35-38.
[9]买合吐木古丽·艾孜不拉，杨栋，高永健. 农药增效剂激健在棉叶螨防治中的应用效果[J]. 中国植保导刊，2014（11）：63-64.
[10]谢伶刚，方春华，吴卫国. 激健在茶尺蠖及茶小绿叶蝉防治中的减量化作用研究[J]. 现代农业科技，2014（15）：135-136.
[11]刘朝科，于艳梅，汪 莹，等. 增效剂“倍创”对烟田农药的减量增效作用[J]. 植物医生，2013（1）：51-52.
[12]张广和，于晓丽，栾炳辉，等. 倍创与杀菌剂混用对葡萄果实病害的防效评价[J]. 北方园艺，2013（4）：127-129.
[13]于晓丽，王培松，栾炳辉，等. 倍创与不同杀菌剂混用对葡萄霜霉病的防治效果评价[J]. 中国果树，2013（3）：59-60.
[14]王 琼，陈国奇，姜英，等. 水稻田稗属（Echinochloa spp.）杂草对稻田常用除草剂的敏感性[J]. 南京农业大学学报，2015，38（5）：804-809.
[15]刘庆虎，陈国奇，张玉华，等. 不同叶龄千金子、稗和马唐对氰氟草酯和五氟磺草胺的敏感性[J]. 南京农业大学学报，2016，39（5）：771-776. [16]卢向阳，徐 筠. 两种喷雾助剂对氟磺胺草醚在反枝苋上的吸收和药效的影响[J]. 农药学学报，2006，8（2）：162-166.
[17]李 娟，何雄奎，李红军，等. 表面活性剂水溶液与叶片表面的接触角以及持留量之间的相关性初探[C]//农药与环境安全国际会议论文集.北京：中国农业大学出版社，2005：403-407.
[18]Yu Q，Han H，Vila-Aiub M M，et al. AHAS herbicide resistance endowing mutations：effect on AHAS functionality and plant growth[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（14）：3925-3934.
[19]Li L X，Du L，Liu W T，et al. Target-site mechanism of ACCase-inhibitors resistance in American sloughgrass （Beckmannia syzigachne Steud.） from China[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2014，110：57-62.
[20]Li L X，Liu W T，Chi Y C，et al. Molecular mechanism of mesosulfuron-methyl resistance in multiply-resistant American sloughgrass （Beckmannia syzigachne） [J]. Weed Science，2015，63（4）：781-787.
[21]顏欣茹，杨俊雪，薛 君，等. 抗性和敏感生物型菵草代谢精唑禾草灵的速度差异[J]. 杂草学报，2017，35（1）：15-19.
[22]Penner D. Activator adjuvant[J]. Weed Technology，2000，14（4）：785-791.
[23]肖慰祖，王红春，沈文飚，等. 植物油助剂GY-Tmax对双草醚和氰氟草酯的增效作用和安全性的影响[J]. 杂草学报，2018，36（2）：41-47.
关键词：菵草;精唑禾草灵抗性;助剂激健;整株生物测定;小麦安全性;增效机制
中图分类号：S451.2 文献标志码：A 文章编号：1003-935X（2019）01-0056-08
Abstract：This study aims to clarify whether the adjuvant Jijian （whose main ingredients are non-ionic surfactant，methyloleate，corn germ oil，Camellia oleifera seed oil） has a synergistic effect on mesosulfuron-methyl for the control of fenoxaprop-P-ethyl-resistant Beckmannia syzigachne，andto determine the best synergistic dose and mechanism.Whole-plant bioassayswere used to screen the best synergistic dose of adjuvant Jijian;thesynergism mechanism was explored by testing the influence of Jijian on physical indexes such as surface tension，contactangle，expanded diameter and maximum retention of the pesticide liquid. The effect Jijian to ALS enzyme activity in fenoxaprop-P-ethyl-resistant B.syzigachnewas also tested. The best combination dose was mesosulfuron-methyl 12 g a.i./hm2+Jinjian 0.05% （V/V）. Jijian significantly reduced the surface tension and contact angle of the pesticide liquid while increasing the expanded diameter and the maximum retention. Jijianhad no significant effect on the ALS enzyme activity of fenoxaprop-P-ethyl-resistant B.syzigachne. Jijianhad a synergistic effect on mesosulfuron-methyl in controllingfenoxaprop-P-ethyl-resistant B.syzigachne. The synergistic effect was exerted mainly by changing the physicochemical properties of the herbicide liquid，with no affect on the activity of the target enzyme at the physiological and biochemical level.
Key words：Beckmannia syzigachne;fenoxaprop-P-ethyl-resistant;adjuvant;whole plant bioassay;safety to wheat;synergistic mechanism
精唑禾草靈为芳氧基苯氧基丙酸酯类（AOPPs）除草剂，其作用靶标为乙酰辅酶A羧化酶（ACCase），因其活性高、杀草谱广而被广泛用于小麦田防除一年生禾本科杂草。由于长期单一使用该除草剂，并逐年增加用量，从而导致其药效下降。张锁荣发现，菵草在连续多年使用精唑禾草灵后已对其产生了抗药性[1]。笔者所在实验室的潘浪等通过环介导等温扩增（LAMP）和衍生酶切扩增多态性（dCAPS）方法检测发现，抗精唑禾草灵菵草存在I1781L、W2027C、I2041A、D2078G及G2096A等5种不同类型的突变，并且不同ACCase突变类型的菵草与其对精唑禾草灵的抗性程度之间存在一定关系，即相对抗性倍数越高的菵草种群，其纯合突变的频率也越高;同时，确定了不同突变位点对烯草酮、唑啉草酯、高效氟吡甲禾灵、炔草酸等AOPPs类除草剂不同水平的交互抗性[2]。除靶标抗性外，菵草对精唑禾草灵还存在非靶标抗性，潘浪等研究发现，用胡椒基丁醚（PBO）或1-氨基苯并三唑（ABT）预处理，可以不同程度地提高精唑禾草灵对抗性菵草的抑制作用，这表明细胞色素P450系统在菵草对精唑禾草灵的抗性中起着一定程度的作用[3]。由于菵草对ACCase抑制剂类除草剂的交互抗性及代谢抗性问题日渐严重，在正常田间推荐剂量下，精唑禾草灵、炔草酯、唑啉草酯等小麦田常用除草剂已经不能对其进行有效的防除。 甲基二磺隆（mesosulfuron-methyl）为磺酰脲类除草剂，其作用靶标为乙酰乳酸合酶（ALS）。在小麦田杂草对精唑禾草灵抗药性日益严重的情况下，甲基二磺隆逐渐成为治理麦田恶性杂草的有效除草剂品种之一[4-5]。但是由于甲基二磺隆对施药技术要求较高，施药剂量过大而引起的药害现象时有发生。因此，在不降低其田间防除效果的前提下，找到一种能够减少除草剂用量，同时对小麦安全的除草剂助剂是一种理想的解决办法。
作为除草剂助剂的表面活性剂有非离子型、阳离子型和阴离子型。其中非离子型表面活性剂的通用性较强，是除草剂中应用最广泛的一种助剂[6]。激健（主要成分为非离子表面活性剂、油酸甲酯、玉米胚芽油、油茶籽油等）是多元醇类非离子表面活性剂，它与农药混用，可以增强农药的渗透性和传导性，减少农药的使用量[7]，同时对作物、人畜、环境安全[8]。研究表明，激健在农药防治棉叶螨、茶尺蠖、小绿叶蝉、葡萄霜霉病等病虫害中表现出较好的增效减量作用，但在田间杂草防治过程中的报道较少[9-13]。本研究以兼具细胞色素P450氧化酶系代谢抗性的G2096A位点突变的抗精唑禾草灵菵草、助剂激健及甲基二磺隆为试验材料，旨在明确激健对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草的增效作用，确定激健的最佳增效剂量，找到激健与甲基二磺隆的最佳剂量组合，验证其对小麦的安全性，并在物理性状层面及抗精唑禾草灵菵草ALS活性上初步阐明其增效减量作用机制，为小麦田抗精唑禾草灵菵草的治理及除草剂的减量使用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
抗精唑禾草灵菵草种子于2014年5月采自江苏省扬州市江都区。其对精唑禾草灵的GR50值（使杂草生物量降低50%的除草剂剂量）为 1 324.75 g a.i./hm2，相对抗性倍数为31.05，抗性机制为靶标抗性以及代谢抗性，靶标位点为G2096A突变，代谢抗性机制为细胞色素P450氧化酶系代谢的加强[3]。小麦种子品种为镇麦6号，2016年6月由阜宁县农业科学研究所提供。
将采集的菵草种子清洁晾干后装入尼龙网袋内，室外埋土1个月解除休眠，取出后于室内晾干并装入纸袋内，与小麦种子一同置于4 ℃冷藏冰箱内储藏，备用。
1.2 供试药剂与助剂
供试药剂及喷施剂量见表1。
1.3 试验方法
1.3.1 激健最佳增效剂量的筛选 采用室内整株生物测定法测定[14-15]。在规格为7 cm×7 cm×7 cm 的塑料杯中装入未使用过除草剂的有机土，pH值为6.7，有机质含量为1.59%，加水至饱和。选择籽粒饱满的抗精唑禾草灵的菵草种子，在每个塑料杯中播种20粒，然后再覆1层细土，放入温室中生长，其温度设置为光照时20 ℃，黑暗时15 ℃，光—暗周期为12 h—12 h，抗精唑禾草灵菵草出苗后定苗至15株，待抗精唑禾草灵菵草长至3～5叶期，采用茎叶喷雾处理法对其进行药剂处理，对照喷施等量清水，每个处理重复4次。助剂激健的推荐剂量为0.05%，设置助剂剂量为0、0.03%、0.04%、0.05%和0.06%（均为体积分数，下同），30g/L甲基二磺隆油悬浮剂剂量设置为推荐剂量的60%，即8 g a.i./hm2，激健各处理与甲基二磺隆设置剂量混合。喷雾采用农业农村部南京农业机械化研究所生产的3WP-2000型行走式生测喷雾塔，主轴转动速度为96 mm/r，喷雾高度为300 mm，喷头有效喷幅为350 mm，喷头流量为390 mL/min，行走距离为1 340 mm，药液体积为30 mL。待药剂晾干后，放入温室内培养，施药后14 d剪下各处理抗精唑禾草灵菵草地上部分，称鲜重，计算鲜重抑制率。
1.3.2 激健对甲基二磺隆增效减量剂量的测定 采用室内整株生物测定法测定[14-15]。在每个塑料杯中播种20粒抗精唑禾草灵菵草种子，土壤和培养条件同“1.3.1”节，待抗精唑禾草灵菵草长至3～5叶期，采取茎叶喷雾处理法对其进行药剂处理，对照喷施等量清水，每个处理重复4次。30 g/L甲基二磺隆油悬浮剂剂量设置为0、8、12、16 g a.i./hm2，各药剂处理加入0.05%激健，以甲基二磺隆单剂作为对照。茎叶喷雾处理方法同“1.3.1”节，待药剂晾干后，放入温室内培养，施药后14 d剪下各处理抗精唑禾草灵菵草地上部分，称鲜重，计算鲜重抑制率。
1.3.3 激健对小麦安全性的测定 采用室内整株生物测定法测定[14-15]。在每个塑料杯中播种10粒小麦种子，土壤和培养条件同“1.3.1”节，小麦出苗后定苗至8株，药剂剂量设置及喷雾处理方法同“1.3.1”节及“1.3.2”节。待药剂晾干后，放入温室内培养，施药后15 d剪下各处理小麦地上部分，称鲜重，计算鲜重抑制率，比较各处理之間小麦的鲜重差异显著性。
鲜重抑制率的计算公式如下：
鲜重抑制率=（对照鲜重-处理鲜重）/对照鲜重×100%。
1.3.4 激健对甲基二磺隆药液物理性状的影响测定 将激健按照0.05%的体积分数加入 8 g a.i./hm2 甲基二磺隆药液中，测定蒸馏水（对照CK）、0.05%激健（处理1）、8 g a.i./hm2甲基二磺隆（处理2）及0.05%激健+8 g a.i./hm2甲基二磺隆（处理3）4种样品的表面张力、接触角、扩展直径及最大持留量等物理性状指标。
1.3.4.1 激健对甲基二磺隆药液表面张力的影响测定 分别取各处理待测液，用自动界面张力仪测定其表面张力，记录数值，每个处理设4个重复。
1.3.4.2 激健对甲基二磺隆药液接触角的影响测定 分别取各处理待测液，利用接触角测量仪测定上述药液的接触角，记录数值，每个处理设4个重复。
1.3.4.3 激健对甲基二磺隆药液扩展直径的影响测定 参照卢向阳等的测定方法[16]，用移液枪吸取各处理溶液2.5 μL滴在石蜡玻片表面，置于双筒解剖镜下观察，待液滴充分扩展后，干燥前用测微尺测量液滴的最大直径、最小直径，将二者均值作为液滴直径。记录数值，每个处理设4个重复。 1.3.4.4 激健对甲基二磺隆药液最大持留量的影响测定 采用浸渍法[17]，剪取抗精唑禾草灵菵草的叶片称质量（m0），然后将其垂直浸入药液中保持3 s，迅速将叶片拉出液面，垂直悬置，待其不再有液滴流淌时称质量（m1），用叶面积仪测定叶片的面积（S），计算叶片对药液的最大持留量Rm。记录数值，每个处理设4个重复。计算公式：Rm=（m1-m0）/S。
1.3.5 激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性的影响测定 采用测定粗酶液的方法测定抗精唑禾草灵菵草离体ALS活性，参照Yu等的方法[18]并略作修改。剪取3 g 3～4叶期抗精唑禾草灵菵草叶片，剪碎后放入液氮中迅速研磨成粉，待液氮挥发后，加入6 mL酶提取液[含有5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP（焦磷酸硫胺素）、0.1 mol/L FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）、含10 mmol/L丙酮酸钠的pH值=7.0的磷酸缓冲液]，用2层尼龙纱网过滤到预冷的离心管中，获得粗酶液，以上步骤均在 0～4 ℃条件下进行。将粗酶液在4 ℃、27 000 g 条件下离心15 min，小心移取上清液，置于干净的离心管中。取1.5 mL离心管若干，分别加入100 μL酶反应液（含有5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L TPP、0.1 mol/L FAD、含100 mmol/L丙酮酸钠的pH值=7.0的磷酸缓冲液）、100 μL酶液，再分别加入0.05%激健（处理1）、0.1 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理2）、0.05%激健+0.1 μmol/L 甲基二磺隆原药溶液（处理3）、1 μmol/L 甲基二磺隆原药溶液（处理4）、0.05%激健+1 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理5）、10 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理6）、0.05%激健+10 μmol/L甲基二磺隆原药溶液（处理7）各100 μL，设蒸馏水为对照（CK）。将反应液摇匀后置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min，向每个试管中加入40 μL 6 mol/L H2SO4终止反应;将反应试管置于60 ℃水浴中保溫15 min，向每支离心管中分别加入现配制的0.5%肌酸和5%1-萘酚（溶于2.5 mol/L NaOH溶液）各200 μL，60 ℃水浴保温15 min，冷却至室温后，从每支反应试管中取出200 μL反应溶液加入到96孔酶标板中，测定D530 nm。每个药剂处理设3个重复。
1.4 数据处理
用Excel、DPS v15.10等软件进行数据处理及差异显著性分析，多重比较采用Duncans 法。
2 结果与分析
2.1 激健最佳增效剂量
由表2可知，在助剂剂量设置范围内，随着助剂剂量的提高，添加激健的甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率逐渐提升，表明激健对甲基二磺隆有增效作用。由鲜重抑制率的差异显著性分析可以看出，添加激健剂量为0.05%时的鲜重抑制率显著高于添加激健剂量为0.03%、0.04%的处理，而与添加激健剂量为0.06%时无显著差异，由此可见， 随着激健剂量的提高，甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率逐渐提高，当激健剂量达到0.05%时，随着激健剂量的提升，鲜重抑制率无显著变化，因此，激健的最佳增效剂量为0.05%。
2.2 激健对甲基二磺隆的增效剂量
由表3可知，在甲基二磺隆剂量设置范围内，添加激健的甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率提高了2.60～7.94百分点。当甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的鲜重抑制率为90%时，甲基二磺隆的用量略大于 16 g a.i./hm2，添加激健后，甲基二磺隆的用量略小于 12 g a.i./hm2，二者相比，甲基二磺隆的用量减少了25%以上。由此可见，激健的加入能够在一定程度上减少甲基二磺隆的用量。
2.3 激健对小麦安全性的测定
由表4可知，在激健与甲基二磺隆剂量设置范围内，添加激健的甲基二磺隆在不同助剂剂量下以及不同药剂剂量下，各鲜重之间均无显著差异，药后观察无药害发生，这表明激健对小麦安全。
2.4 激健对甲基二磺隆药液物理性状的影响
与蒸馏水对照相比，激健能够显著降低蒸馏水以及甲基二磺隆药液样品的表面张力（图1）。蒸馏水的表面张力为72.44 mN/m，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液表面张力均显著低于蒸馏水对照，分别为20.70、21.34 mN/m;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，其表面张力显著降低，为 18.17 mN/m，显著低于蒸馏水对照、甲基二磺隆单剂处理。
与蒸馏水对照相比，激健能够显著降低蒸馏水及甲基二磺隆药液样品的接触角（图2）。蒸馏水与抗精唑禾草灵菵草叶面的接触角为116.88°，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液与抗精唑禾草灵菵草叶面的接触角分别为72.63°、74.75°;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，与抗精唑禾草灵菵草叶面的接触角为65.38°，显著低于蒸馏水对照和甲基二磺隆单剂处理。
与蒸馏水对照相比，激健能够显著增大蒸馏水以及甲基二磺隆药液样品的扩展直径（图3）。蒸馏水的扩展直径为3.70 mm，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液的扩展直径分别为4.60、4.54 mm;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，其扩展直径为5.01 mm，显著高于蒸馏水对照和甲基二磺隆单剂。
与蒸馏水对照相比，激健能够显著增大蒸馏水及甲基二磺隆药液样品的最大持留量（图4）。蒸馏水的最大持留量为0.75 mg/cm2，0.05%激健水溶液、8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液的最大持留量分别为9.85、10.15 mg/cm2;在8 g a.i./hm2甲基二磺隆药液中加入0.05%激健后，其最大持留量为12.50 mg/cm2，显著高于蒸馏水对照和甲基二磺隆单剂。由于激健对样品物理性状的改变，增加了药液的润湿展布性能，从而有助于发挥其增效减量的作用。 2.5 激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性的影响
由图5可知，处理1与CK、处理2与处理3、处理4与处理5、处理6与处理7之间在乙酰乳酸合酶活性上均无显著差异，表明激健对抗精唑禾草灵菵草ALS活性无明显影响，激健的加入不能影响甲基二磺隆对抗精唑禾草灵菵草的ALS活性。
3 讨论与结论
随着菵草对精唑禾草灵以及小麦田其他常用ACCase抑制剂类除草剂如唑啉草酯、炔草酯等药剂的交互抗性问题日渐严重[19-21]，给小麦田抗药性菵草的防除带来了极大的挑战。而小麦田菵草对以甲基二磺隆为主的ALS抑制类除草剂的抗性发生程度较低[20]，因此，甲基二磺隆仍可用于小麦田抗精唑禾草灵菵草的防除。但是甲基二磺隆在田间过量使用时，极易产生药害问题，因此可以通过添加助剂提高其防除效果，减少其有效成分用量，可以在一定程度上解决药害问题，同时可以延缓甲基二磺隆抗性的发生。
本研究确定了激健对甲基二磺隆防除抗精唑禾草灵菵草具有增效作用，其最佳增效剂量为0.05%。在12 g a.i./hm2甲基二磺隆+0.05%激健处理下，其对抗精唑禾草灵菵草的室内毒力效果可以达到90%以上的鲜重抑制率，与甲基二磺隆的最高推荐剂量16 g a.i./hm2相比，其有效成分用量减少了25%。在0.05%激健和8～16 g a.i./hm2 甲基二磺隆范围内，甲基二磺隆和激健在任一剂量搭配时，各处理组小麦鲜重之间均无显著差异，药后观察无药害发生，这表明在以上范围内，激健与甲基二磺隆组合对小麦安全。12 g a.i./hm2甲基二磺隆+0.05%激健的组合，既可有效防除抗精唑禾草灵菵草，又能减少甲基二磺隆的用量，并且对小麦安全。
研究结果表明，激健的加入能够显著降低蒸馏水以及甲基二磺隆药液的表面张力、接触角，显著增大蒸馏水以及甲基二磺隆药液的扩展直径以及最大持留量等理化性质，但是激健并不能影响抗精唑禾草灵菵草的ALS活性。综合这2个因素，说明激健主要通过改变药液在杂草叶片的润湿展布性能，增加或加速杂草对药液的吸收，从而发挥其增效减量作用。这与目前报道的油类助剂增效机制，即延长喷雾雾滴干燥时间、促进药剂吸收和叶面渗透、促进药剂在难以湿润靶标上的黏附和扩散以利于农药吸收等[22-23]是一致的。但激健并不能通过影响抗精唑禾草灵菵草靶标酶的活性发挥其增效作用。至于激健是否有更深层次的增效作用机制，还有待进一步研究及验证。
参考文献：
[1]张锁荣. 苏南地区稻麦连作田菵草对精唑禾草灵的抗药性及控制方法研究[D]. 南京：南京农业大学，2007.
[2]Pan L，Li J，Xia W W，et al. An effective method，composed of LAMP and dCAPS，to detect different mutations in fenoxaprop-P-ethyl-resistant American sloughgrass （Beckmannia syzigachne Steud.） populations[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2015，117：1-8.
[3]Pan L，Li J，Zhang T，et al. Cross-resistance patterns to acetyl coenzyme A carboxylase （ACCase） inhibitors associated with different ACCase mutations in Beckmannia syzigachne[J]. Weed Research，2015，55（6）：609-620.
[4]唐建明. 江蘇麦田恶性禾本科杂草及其适用除草药剂[J]. 杂草科学，2008（3）：75-76.
[5]张敏恒. 磺酰脲类除草剂的发展现状、市场与未来趋势[J]. 农药，2010，49（4）：235-240.
[6]王成菊，张文吉. 助剂在除草剂应用中的作用及发展前景[J]. 农药学学报，2003，5（1）：441-446.
[7]宋朝凤，王洪涛，王英姿. 农药助剂倍创对辛硫磷防治韭菜韭蛆的增效作用[J]. 北方园艺，2015（9）：99-101.
[8]徐建军，何强章. 农药增效助剂倍创的创制与应用研究[J]. 山东农药信息，2010（4）：35-38.
[9]买合吐木古丽·艾孜不拉，杨栋，高永健. 农药增效剂激健在棉叶螨防治中的应用效果[J]. 中国植保导刊，2014（11）：63-64.
[10]谢伶刚，方春华，吴卫国. 激健在茶尺蠖及茶小绿叶蝉防治中的减量化作用研究[J]. 现代农业科技，2014（15）：135-136.
[11]刘朝科，于艳梅，汪 莹，等. 增效剂“倍创”对烟田农药的减量增效作用[J]. 植物医生，2013（1）：51-52.
[12]张广和，于晓丽，栾炳辉，等. 倍创与杀菌剂混用对葡萄果实病害的防效评价[J]. 北方园艺，2013（4）：127-129.
[13]于晓丽，王培松，栾炳辉，等. 倍创与不同杀菌剂混用对葡萄霜霉病的防治效果评价[J]. 中国果树，2013（3）：59-60.
[14]王 琼，陈国奇，姜英，等. 水稻田稗属（Echinochloa spp.）杂草对稻田常用除草剂的敏感性[J]. 南京农业大学学报，2015，38（5）：804-809.
[15]刘庆虎，陈国奇，张玉华，等. 不同叶龄千金子、稗和马唐对氰氟草酯和五氟磺草胺的敏感性[J]. 南京农业大学学报，2016，39（5）：771-776. [16]卢向阳，徐 筠. 两种喷雾助剂对氟磺胺草醚在反枝苋上的吸收和药效的影响[J]. 农药学学报，2006，8（2）：162-166.
[17]李 娟，何雄奎，李红军，等. 表面活性剂水溶液与叶片表面的接触角以及持留量之间的相关性初探[C]//农药与环境安全国际会议论文集.北京：中国农业大学出版社，2005：403-407.
[18]Yu Q，Han H，Vila-Aiub M M，et al. AHAS herbicide resistance endowing mutations：effect on AHAS functionality and plant growth[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（14）：3925-3934.
[19]Li L X，Du L，Liu W T，et al. Target-site mechanism of ACCase-inhibitors resistance in American sloughgrass （Beckmannia syzigachne Steud.） from China[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2014，110：57-62.
[20]Li L X，Liu W T，Chi Y C，et al. Molecular mechanism of mesosulfuron-methyl resistance in multiply-resistant American sloughgrass （Beckmannia syzigachne） [J]. Weed Science，2015，63（4）：781-787.
[21]顏欣茹，杨俊雪，薛 君，等. 抗性和敏感生物型菵草代谢精唑禾草灵的速度差异[J]. 杂草学报，2017，35（1）：15-19.
[22]Penner D. Activator adjuvant[J]. Weed Technology，2000，14（4）：785-791.
[23]肖慰祖，王红春，沈文飚，等. 植物油助剂GY-Tmax对双草醚和氰氟草酯的增效作用和安全性的影响[J]. 杂草学报，2018，36（2）：41-47.