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摘要：漆酶（laccase），是一种典型的绿色催化剂，应用范围广泛。目前工业化的漆酶商品主要来源真菌发酵，但在高温、高盐或强碱性等极端环境中，真菌漆酶易失活，限制了其应用范围。相比之下，细菌漆酶具有耐高温、耐高碱性的优势，且发酵生产周期短，具有广阔的推广前景。现归纳近年来关于产漆酶菌株的分离、漆酶的克隆表达等研究成果，对高温漆酶的克隆表达和性能研究对于拓展漆酶的范围、深入地进行高温漆酶的理论研究，指出高温漆酶良好的开发前景，以此来扩大漆酶的应用范围。
关键詞：高温漆酶；克隆表达；性能
漆酶（Laccase， p-diphenoldioxygen：oxidoreductase， EC 1.10.3. 2），即p-对苯二酚：双氧氧化还原酶，是一种多酚类氧化还原蛋白，属于蓝多铜氧化酶家族（bluemulticopperoxid- oreductase， BMCOs）[1]。漆酶具有特殊的催化性能和非常宽泛的底物专一性，能够利用多种酚类化合物及其衍生物、芳香胺及其衍生物等为氢供体，以O2为电子受体，催化底物氧化使之生成相应的苯配和水，是一种环境友好的绿色催化剂[2]。
漆酶的底物非常广泛，主要是酚类化合物、芳胺类、芳香梭酸类、甾体激素及生物色素、金属有机化合物等[3， 4]。因此，漆酶可以用来处理木质素、酚类污染物、农药、除草剂等，在环境保护、造纸工业、食品工业等领域具有很大的研究和应用价值，另外，利用漆酶进行药物的修饰加工、功能高分子材料的合成也是近年来研究的热点之一[5]，热稳定性较好的漆酶因在污水处理、功能高分子的合成等领域具有独特的应用价值而倍受关注[6， 7]。
1.获取耐高温漆酶的基因片段
提取嗜热芽孢杆菌DNA；设计引物，获得仅表达高温漆酶的基因片段，并用PCR技术进行扩增；将基因片段连接到载体上，并转入表达型大肠杆菌细胞（BL21）；测序，验证所获片段是否为耐高温片段；分离纯化BL21表达的蛋白，该蛋白即为高温漆酶。
2.高温漆酶的耐受温度范围及最适反应温度
高温漆酶最适反应温度为60℃，该高温漆酶在20℃-90℃均具备活性。但因为温度梯度以10℃为间隔，根据曲线趋势观察，最适反应温度也有可能介于50℃-60℃之间。
3.高温漆酶的耐受pH范围
经测量可知，高温漆酶在4-11pH值的条件下酶活大小有较大变化，在4.0、5.0、9.0、10.0和11.0的條件下，高温漆酶的酶活几乎接近于0%，而在pH值为7.0时相对酶活达到最大。可知高温漆酶的pH耐受范围为5.0-9.0，最适pH反应条件为7.0。
4.抑制剂、有机溶剂对高温漆酶的活性影响
4.1抑制剂对高温漆酶的活性影响
抑制剂对酶活的影响如表1所示。三种抑制剂中DDT对高温漆酶的一直效果最显著，DDT浓度为0.1mmol/L时就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA对高温漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明显，在浓度为100mmol/L时，残余酶活性仍旧能够达到50%以上；SDS对高温漆酶不仅没有较强的抑制作用，反而对酶活有一定的促进作用，当SDS浓度为10mmol/L时，酶活性仍有升高现象。
4.2有机溶剂对高温漆酶的活性影响
根据测量可知，高温漆酶的活性随着有机溶剂浓度的升高而降低。三种有机溶剂中，丙酮和乙醇对高温漆酶活性的影响比甲醇要大，当乙醇和丙酮的浓度达到20%时，高温漆酶的残余酶活就下降到了50%以下。
5.结论
通过研究发现，高温漆酶最适反应温度为60℃，该高温漆酶在20℃-90℃均具备活性；高温漆酶的pH耐受范围为5.0-9.0，最适pH反应条件为7.0；DDT对高温漆酶的一直效果最显著，DDT浓度为0.1mmol/L时就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA对高温漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明显，在浓度为100mmol/L时，残余酶活性仍旧能够达到50%以上；SDS对高温漆酶不仅没有较强的抑制作用，反而对酶活有一定的促进作用，当SDS浓度为10mmol/L时，酶活性仍有升高现象。
高温漆酶的活性随着有机溶剂浓度的升高而降低。三种有机溶剂中，丙酮和乙醇对高温漆酶活性的影响比甲醇要大，当乙醇和丙酮的浓度达到20%时，高温漆酶的残余酶活就下降到了50%以下。此高温漆酶对结晶紫和靓红有很强的脱色效果，此高漆酶酶的酶学性质表明此酶具有一定的工业化应用价值。
参考文献：
[1]Galhaup C， Goller S， Peterbauer CK， Strauss J， Haltrich D. Characterization of the major laccaseisoenzyme from Trametespubescens and regulation of its synthesis by metal ionsa[J]. Microbiology. 2002，148（7）： 2159-2169.
[2]陶亮亮. 重组里氏木霉产耐髙温漆酶的研究 [D]. 杭州： 浙江大学. 2014.
[3]Baldrian P. Fungal laccases–occurrence and properties [J]. FEMS microbiology reviews. 2006，30（2）：215-242.
[4]宋安东， 王艳婕， 王松江， 戚元成， 吴坤. 漆酶的分子生物学研究及其应用[J]. 信阳师范学院学报： 自然科学版. 2004，17（2）：244-248.
[5]Riva S. Laccases： blue enzymes for green chemistry[J]. TRENDS in Biotechnology. 2006，24（5）：219-226.
[6]Chairattanamanokorn P， Imai T， Kondo R， Ukita M， Prasertsan P. Screening thermotolerant white-rot fungi for decolorization of wastewaters[J]. Applied biochemistry and biotechnology. 2006，128（3）：195-204.
[7]Kiiskinen LL， R?tt? M， Kruus K. Screening for novel laccase‐producing microbes[J]. Journal of applied microbiology. 2004，97（3）：640-646.
关键詞：高温漆酶；克隆表达；性能
漆酶（Laccase， p-diphenoldioxygen：oxidoreductase， EC 1.10.3. 2），即p-对苯二酚：双氧氧化还原酶，是一种多酚类氧化还原蛋白，属于蓝多铜氧化酶家族（bluemulticopperoxid- oreductase， BMCOs）[1]。漆酶具有特殊的催化性能和非常宽泛的底物专一性，能够利用多种酚类化合物及其衍生物、芳香胺及其衍生物等为氢供体，以O2为电子受体，催化底物氧化使之生成相应的苯配和水，是一种环境友好的绿色催化剂[2]。
漆酶的底物非常广泛，主要是酚类化合物、芳胺类、芳香梭酸类、甾体激素及生物色素、金属有机化合物等[3， 4]。因此，漆酶可以用来处理木质素、酚类污染物、农药、除草剂等，在环境保护、造纸工业、食品工业等领域具有很大的研究和应用价值，另外，利用漆酶进行药物的修饰加工、功能高分子材料的合成也是近年来研究的热点之一[5]，热稳定性较好的漆酶因在污水处理、功能高分子的合成等领域具有独特的应用价值而倍受关注[6， 7]。
1.获取耐高温漆酶的基因片段
提取嗜热芽孢杆菌DNA；设计引物，获得仅表达高温漆酶的基因片段，并用PCR技术进行扩增；将基因片段连接到载体上，并转入表达型大肠杆菌细胞（BL21）；测序，验证所获片段是否为耐高温片段；分离纯化BL21表达的蛋白，该蛋白即为高温漆酶。
2.高温漆酶的耐受温度范围及最适反应温度
高温漆酶最适反应温度为60℃，该高温漆酶在20℃-90℃均具备活性。但因为温度梯度以10℃为间隔，根据曲线趋势观察，最适反应温度也有可能介于50℃-60℃之间。
3.高温漆酶的耐受pH范围
经测量可知，高温漆酶在4-11pH值的条件下酶活大小有较大变化，在4.0、5.0、9.0、10.0和11.0的條件下，高温漆酶的酶活几乎接近于0%，而在pH值为7.0时相对酶活达到最大。可知高温漆酶的pH耐受范围为5.0-9.0，最适pH反应条件为7.0。
4.抑制剂、有机溶剂对高温漆酶的活性影响
4.1抑制剂对高温漆酶的活性影响
抑制剂对酶活的影响如表1所示。三种抑制剂中DDT对高温漆酶的一直效果最显著，DDT浓度为0.1mmol/L时就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA对高温漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明显，在浓度为100mmol/L时，残余酶活性仍旧能够达到50%以上；SDS对高温漆酶不仅没有较强的抑制作用，反而对酶活有一定的促进作用，当SDS浓度为10mmol/L时，酶活性仍有升高现象。
4.2有机溶剂对高温漆酶的活性影响
根据测量可知，高温漆酶的活性随着有机溶剂浓度的升高而降低。三种有机溶剂中，丙酮和乙醇对高温漆酶活性的影响比甲醇要大，当乙醇和丙酮的浓度达到20%时，高温漆酶的残余酶活就下降到了50%以下。
5.结论
通过研究发现，高温漆酶最适反应温度为60℃，该高温漆酶在20℃-90℃均具备活性；高温漆酶的pH耐受范围为5.0-9.0，最适pH反应条件为7.0；DDT对高温漆酶的一直效果最显著，DDT浓度为0.1mmol/L时就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA对高温漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明显，在浓度为100mmol/L时，残余酶活性仍旧能够达到50%以上；SDS对高温漆酶不仅没有较强的抑制作用，反而对酶活有一定的促进作用，当SDS浓度为10mmol/L时，酶活性仍有升高现象。
高温漆酶的活性随着有机溶剂浓度的升高而降低。三种有机溶剂中，丙酮和乙醇对高温漆酶活性的影响比甲醇要大，当乙醇和丙酮的浓度达到20%时，高温漆酶的残余酶活就下降到了50%以下。此高温漆酶对结晶紫和靓红有很强的脱色效果，此高漆酶酶的酶学性质表明此酶具有一定的工业化应用价值。
参考文献：
[1]Galhaup C， Goller S， Peterbauer CK， Strauss J， Haltrich D. Characterization of the major laccaseisoenzyme from Trametespubescens and regulation of its synthesis by metal ionsa[J]. Microbiology. 2002，148（7）： 2159-2169.
[2]陶亮亮. 重组里氏木霉产耐髙温漆酶的研究 [D]. 杭州： 浙江大学. 2014.
[3]Baldrian P. Fungal laccases–occurrence and properties [J]. FEMS microbiology reviews. 2006，30（2）：215-242.
[4]宋安东， 王艳婕， 王松江， 戚元成， 吴坤. 漆酶的分子生物学研究及其应用[J]. 信阳师范学院学报： 自然科学版. 2004，17（2）：244-248.
[5]Riva S. Laccases： blue enzymes for green chemistry[J]. TRENDS in Biotechnology. 2006，24（5）：219-226.
[6]Chairattanamanokorn P， Imai T， Kondo R， Ukita M， Prasertsan P. Screening thermotolerant white-rot fungi for decolorization of wastewaters[J]. Applied biochemistry and biotechnology. 2006，128（3）：195-204.
[7]Kiiskinen LL， R?tt? M， Kruus K. Screening for novel laccase‐producing microbes[J]. Journal of applied microbiology. 2004，97（3）：640-646.