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【摘 要】 目的：建立HPLC法测定治咳川贝枇杷露中苯甲酸、羟苯乙酯的含量。方法：色谱柱采用Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm 5 μm），流动相：甲醇-0.02 moL·L-1乙酸铵溶液 梯度程序;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：0～8 min为230 nm 8～20 min为254 nm;进样量：10 μL;柱温：25 ℃。结果：苯甲酸在1.00～5.01 μg（r= 0.9999）范围内呈现良好的线性关系 羟苯乙酯在0.08～0.41μg（r= 1.0000）范围内呈现良好的线性关系 平均加样回收率分别为98.92%（RSD=1.71%，n=9））、100.52%（RSD=1.32%，n=9））。结论：该方法简便准确、专属性强 重现性好 可用于治咳川贝枇杷露中防腐剂的含量测定。
【关键词】 苯甲酸;羟苯乙酯;高效液相色谱法;含量测定
Abstract：Objective To establish a HPLC method to determine the content of benzoic acid and ethyl hydroxybenzoate in Zhike Chuanbei Pipa syrups.Methods HPLC method was used with Agilent Eclipse XDB-C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was methanol—0.02 moL·l-1 ammonium acetate， gradient elution with a flow rate of 1.0 mL·min-1，the detection wavelength was set 230 nm in 0～8 min and 254 nm in 8～20 min，sample volume was 10 μL and the column temperature was 25 ℃.Results The linear range of benzoic acid was 1.00～5.01 μg（r= 0.9999） and ethyl hydroxybenzoate was 0.08～0.41 μg （r=1.0000）， the average recovery of benzoic acid was 98.92%（RSD=1.71%，n=9）and ethyl hydroxybenzoate was 100.52%（RSD=1.32%，n=9）. Conclusion The method is simple，accurate with good specificity and reproducibility and it can be used in the quantitative determination of preservative in Zhike Chuanbei Pipa syrups.
Keywords：Benzoic Acid; Ethyl Hydroxybenzoate; HPLC; Determination
治咳川貝枇杷露收载于《中国药典》2015年版一部 有清热化痰、消炎止咳的功效 多用于感冒及支气管肺炎引起的咳嗽[1]。其中添加的苯甲酸、羟苯乙酯作为防腐剂 可以起到防止微生物污染、霉变的作用 并能保证口服液的稳定性 但如果添加过量会对人体造成一定的伤害。分别测定药品中苯甲酸[2]、羟苯乙酯[3-6]的含量有文献报道 尚无同时测定苯甲酸和羟苯乙酯含量的相关报道 为对两种防腐剂进行质量控制 保证用药的安全性 本研究采用高效液相色谱法同时测定苯甲酸和羟苯乙酯的含量。
1 仪器与试剂
Agilent1260高效液相色谱仪 配置DAD检测器（美国安捷伦）;Sartorius BP211D电子天平（德国赛多利斯）。苯甲酸对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100419-201703，含量99.9%）;羟苯乙酯对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100847-201604 含量99.9%）;治咳川贝枇杷露（广州白云山潘高寿药业股份有限公司 批号：1902014A;1906012A;1909027A）;甲醇（色谱纯 霍尼韦尔贸易上海有限公司）;水为超纯水;其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm 5 μm）;流动相：甲醇-0.02 moL·L-1乙酸铵溶液 梯度程序见表1;流速：1.0 mL·min-1;检测波长见表2;进样量：10 μL;柱温：25 ℃。
2.2 溶液配制
2.2.1 对照品溶液 精密称取羟苯乙酯对照品10.26 mg，制成每1 mL含羟苯乙酯2.05 mg的对照品储备液 精密称取苯甲酸对照品25.06 mg 精密量取上述羟苯乙酯对照品储备液1 mL，置同一100 mL量瓶中 加甲醇溶解 制成每1 mL含苯甲酸0.25 mg、羟苯乙酯0.02 mg的混合溶液 作为混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 精密量取样品1 mL 置10 mL容量瓶中 用甲醇稀释至刻度 即得。
2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例配制不含苯甲酸和羟苯乙酯的阴性对照溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性考察 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液 按2.1 色谱条件进样 记录色谱图 结果如图1所示 图中可见待测成分与其他物质分离良好 分离度均大于1.5 理论板数：苯甲酸5541 羟苯乙酯195205。阴性对照溶液色谱图在待测成分相应位置无干扰峰 表明其他成分对待测成分的测定无干扰。 2.3.2 线性关系考察 分别精密量取2.2.1对照品溶液各4、8、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪进行测定 记录峰面积 以进样量X（μg）为横坐标 以峰面积A为纵坐标 进行线性回归 绘制标准曲线 结果表明 苯甲酸在1.00～5.01 μg范围内 线性关系良好 A=3768.46170X-7.19021 r=0.9999;羟苯乙酯在0.08～0.41 μg范围内 线性关系良好 A=5895.21755X-2.94636 r=1.0000。
2.3.3 精密度试验 精密吸取2.2.1对照品溶液10 μL 按2.1色谱条件连续进样6次 结果苯甲酸、羟苯乙酯峰面积RSD分别为0.43% 0.52%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 取2.2.2供试品溶液分别于0、1、2、4、8、12 h测定 苯甲酸、羟苯乙酯峰面积RSD分别为 0.57%、0.47%（n=6） 表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.3.5 重复性试验 取批号1909027A的样品 制备供试品溶液6份 在2.1色谱条件下测定 6份样品中苯甲酸的平均含量为344.50 mg/瓶 RSD为0.45%（n=6）;羟苯乙酯的平均含量为13.21 mg/瓶 RSD为0.35%（n=6）。表明方法重复性良好。
2.3.6 加标回收试验 精密量取已知苯甲酸、羟苯乙酯含量的样品（批号：1909027A）共9份 精密加入不同体积的2.2.1对照品溶液 照2.1色谱条件进样测定 计算加样回收率。结果见表3。
2.4 样品含量测定 取治咳川贝枇杷口服液样品3批 按2.2.2项下制备供试品溶液 按2.1 色谱条件进样测定 计算苯甲酸和羟苯乙酯的含量。結果见表4。
3 讨论
曾考察甲醇-水对苯甲酸的分离效果 发现苯甲酸不能与相邻峰完全分离 且峰型拖尾严重。而使用甲醇-0.02 moL·L1乙酸铵溶液作为流动相时苯甲酸、羟苯乙酯均能与相邻峰有较好的分离度 且峰型较好。因此本方法采用甲醇-0.02 moL·L-1乙酸铵溶液作为流动相。
利用高效液相色谱仪的光谱功能对进样的2.2.1对照品溶液进行全波长扫描 发现苯甲酸在230 nm波长处有最大吸收 羟苯乙酯在254 nm波长处有最大吸收。故采用分时段变换波长信号的检测方式来对苯甲酸和羟苯乙酯的含量进行测定 检测灵敏度高、相互无干扰 可以同时进行测定。
口服溶液在使用过程中应避免微生物的污染 防腐剂的抑菌作用是必要的。用量过多会对人体肝脏功能产生损害 《中国药典》2015年版四部[7]通则中规定合剂中苯甲酸的用量不得超过0.3% 羟苯乙酯的用量不得超过0.05%。测定的3批样品苯甲酸和羟苯乙酯的用量均在规定范围内。本方法可以在20 min内测定其含量 方法灵敏、准确、稳定 为其含量的分析提供了理想的方法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：1117.
[2]文玉辉 郭璞. 建立口服液体制剂中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量检测方法[J].中国药事 2015 29（3）：313-316.
[3]李丹青 余弛 曹艳. 高效液相色谱法测定氯化钾口服液中羟苯乙酯的含量[J].食品安全质量检测学报 2018 9（12）：3188-3191.
[4]潘涛 肖作奇 欧阳波 等. 6种医院制剂中羟苯乙酯含量测定方法研究 [J].中医药导报 2015，21（6）：56-58.
[5]刘文龙 黄余燕 钟娜娜. HPLC法测定氧氟沙星滴眼液中羟苯乙酯的含量[J].海峡药学 2019 31（3）：61-63.
[6]郝哲 邱会苹 王丽军 等. 双波长HPLC法测定止痒地霜中地塞米松和羟苯乙酯的含量[J].药学实践杂志 2019，37（4）：361-364.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：26.
【关键词】 苯甲酸;羟苯乙酯;高效液相色谱法;含量测定
Abstract：Objective To establish a HPLC method to determine the content of benzoic acid and ethyl hydroxybenzoate in Zhike Chuanbei Pipa syrups.Methods HPLC method was used with Agilent Eclipse XDB-C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was methanol—0.02 moL·l-1 ammonium acetate， gradient elution with a flow rate of 1.0 mL·min-1，the detection wavelength was set 230 nm in 0～8 min and 254 nm in 8～20 min，sample volume was 10 μL and the column temperature was 25 ℃.Results The linear range of benzoic acid was 1.00～5.01 μg（r= 0.9999） and ethyl hydroxybenzoate was 0.08～0.41 μg （r=1.0000）， the average recovery of benzoic acid was 98.92%（RSD=1.71%，n=9）and ethyl hydroxybenzoate was 100.52%（RSD=1.32%，n=9）. Conclusion The method is simple，accurate with good specificity and reproducibility and it can be used in the quantitative determination of preservative in Zhike Chuanbei Pipa syrups.
Keywords：Benzoic Acid; Ethyl Hydroxybenzoate; HPLC; Determination
治咳川貝枇杷露收载于《中国药典》2015年版一部 有清热化痰、消炎止咳的功效 多用于感冒及支气管肺炎引起的咳嗽[1]。其中添加的苯甲酸、羟苯乙酯作为防腐剂 可以起到防止微生物污染、霉变的作用 并能保证口服液的稳定性 但如果添加过量会对人体造成一定的伤害。分别测定药品中苯甲酸[2]、羟苯乙酯[3-6]的含量有文献报道 尚无同时测定苯甲酸和羟苯乙酯含量的相关报道 为对两种防腐剂进行质量控制 保证用药的安全性 本研究采用高效液相色谱法同时测定苯甲酸和羟苯乙酯的含量。
1 仪器与试剂
Agilent1260高效液相色谱仪 配置DAD检测器（美国安捷伦）;Sartorius BP211D电子天平（德国赛多利斯）。苯甲酸对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100419-201703，含量99.9%）;羟苯乙酯对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100847-201604 含量99.9%）;治咳川贝枇杷露（广州白云山潘高寿药业股份有限公司 批号：1902014A;1906012A;1909027A）;甲醇（色谱纯 霍尼韦尔贸易上海有限公司）;水为超纯水;其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm 5 μm）;流动相：甲醇-0.02 moL·L-1乙酸铵溶液 梯度程序见表1;流速：1.0 mL·min-1;检测波长见表2;进样量：10 μL;柱温：25 ℃。
2.2 溶液配制
2.2.1 对照品溶液 精密称取羟苯乙酯对照品10.26 mg，制成每1 mL含羟苯乙酯2.05 mg的对照品储备液 精密称取苯甲酸对照品25.06 mg 精密量取上述羟苯乙酯对照品储备液1 mL，置同一100 mL量瓶中 加甲醇溶解 制成每1 mL含苯甲酸0.25 mg、羟苯乙酯0.02 mg的混合溶液 作为混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 精密量取样品1 mL 置10 mL容量瓶中 用甲醇稀释至刻度 即得。
2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例配制不含苯甲酸和羟苯乙酯的阴性对照溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性考察 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液 按2.1 色谱条件进样 记录色谱图 结果如图1所示 图中可见待测成分与其他物质分离良好 分离度均大于1.5 理论板数：苯甲酸5541 羟苯乙酯195205。阴性对照溶液色谱图在待测成分相应位置无干扰峰 表明其他成分对待测成分的测定无干扰。 2.3.2 线性关系考察 分别精密量取2.2.1对照品溶液各4、8、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪进行测定 记录峰面积 以进样量X（μg）为横坐标 以峰面积A为纵坐标 进行线性回归 绘制标准曲线 结果表明 苯甲酸在1.00～5.01 μg范围内 线性关系良好 A=3768.46170X-7.19021 r=0.9999;羟苯乙酯在0.08～0.41 μg范围内 线性关系良好 A=5895.21755X-2.94636 r=1.0000。
2.3.3 精密度试验 精密吸取2.2.1对照品溶液10 μL 按2.1色谱条件连续进样6次 结果苯甲酸、羟苯乙酯峰面积RSD分别为0.43% 0.52%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 取2.2.2供试品溶液分别于0、1、2、4、8、12 h测定 苯甲酸、羟苯乙酯峰面积RSD分别为 0.57%、0.47%（n=6） 表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.3.5 重复性试验 取批号1909027A的样品 制备供试品溶液6份 在2.1色谱条件下测定 6份样品中苯甲酸的平均含量为344.50 mg/瓶 RSD为0.45%（n=6）;羟苯乙酯的平均含量为13.21 mg/瓶 RSD为0.35%（n=6）。表明方法重复性良好。
2.3.6 加标回收试验 精密量取已知苯甲酸、羟苯乙酯含量的样品（批号：1909027A）共9份 精密加入不同体积的2.2.1对照品溶液 照2.1色谱条件进样测定 计算加样回收率。结果见表3。
2.4 样品含量测定 取治咳川贝枇杷口服液样品3批 按2.2.2项下制备供试品溶液 按2.1 色谱条件进样测定 计算苯甲酸和羟苯乙酯的含量。結果见表4。
3 讨论
曾考察甲醇-水对苯甲酸的分离效果 发现苯甲酸不能与相邻峰完全分离 且峰型拖尾严重。而使用甲醇-0.02 moL·L1乙酸铵溶液作为流动相时苯甲酸、羟苯乙酯均能与相邻峰有较好的分离度 且峰型较好。因此本方法采用甲醇-0.02 moL·L-1乙酸铵溶液作为流动相。
利用高效液相色谱仪的光谱功能对进样的2.2.1对照品溶液进行全波长扫描 发现苯甲酸在230 nm波长处有最大吸收 羟苯乙酯在254 nm波长处有最大吸收。故采用分时段变换波长信号的检测方式来对苯甲酸和羟苯乙酯的含量进行测定 检测灵敏度高、相互无干扰 可以同时进行测定。
口服溶液在使用过程中应避免微生物的污染 防腐剂的抑菌作用是必要的。用量过多会对人体肝脏功能产生损害 《中国药典》2015年版四部[7]通则中规定合剂中苯甲酸的用量不得超过0.3% 羟苯乙酯的用量不得超过0.05%。测定的3批样品苯甲酸和羟苯乙酯的用量均在规定范围内。本方法可以在20 min内测定其含量 方法灵敏、准确、稳定 为其含量的分析提供了理想的方法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：1117.
[2]文玉辉 郭璞. 建立口服液体制剂中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量检测方法[J].中国药事 2015 29（3）：313-316.
[3]李丹青 余弛 曹艳. 高效液相色谱法测定氯化钾口服液中羟苯乙酯的含量[J].食品安全质量检测学报 2018 9（12）：3188-3191.
[4]潘涛 肖作奇 欧阳波 等. 6种医院制剂中羟苯乙酯含量测定方法研究 [J].中医药导报 2015，21（6）：56-58.
[5]刘文龙 黄余燕 钟娜娜. HPLC法测定氧氟沙星滴眼液中羟苯乙酯的含量[J].海峡药学 2019 31（3）：61-63.
[6]郝哲 邱会苹 王丽军 等. 双波长HPLC法测定止痒地霜中地塞米松和羟苯乙酯的含量[J].药学实践杂志 2019，37（4）：361-364.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：26.