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[摘 要] 从蛋清中用D152型弱酸阳离子交换树脂提取溶菌酶,将Na+型树脂用于吸附过程中,然后用NaCl溶液洗脱,设计二因素三水平的正交试验.蛋清提取率为-------,最适合的工艺为:10%NaCl洗脱,洗脱速度0.4mL/min.本方法减少了杂蛋白,提高了蛋清的再利用价值,降低了成本.
[关键词] 鸡蛋清 溶菌酶 提取 层析柱法
1、序言：
溶菌酶（lysozyme.Lz）又称胞壁质酶(Nicolle)或N一乙酸胞壁質聚糖水解酶（N-Acetyl-muramide glycan hrdrlase），溶菌酶是一种碱性球蛋白,广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中.哺乳动物的唾液,眼泪,尿,血浆及某些植物如萝卜,卷心菜中都含有溶菌酶.蛋白中溶菌酶含量最丰富鸡,占蛋清总蛋白的3.4％～3.5％，溶菌酶在食品中也有广泛的应用。可以将溶菌酶加在鲜牛奶或奶粉中,以增强食用牛奶和奶粉的婴儿的免疫力。也可以加入到西点、饮品、肉制品中,作为防腐剂以延长产品保质期，近年来，全世界农副产品、水产品、果蔬等食品腐烂变质而引起的经济损失十分巨大。如何防止食品的腐败变质越来越引起人们的重视，有关食品防腐剂的研究也日趋完善，食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂，过去，人们大都使用合成防腐剂，但经长期的研究发现一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题，如苯甲酸盐可能会引起食物中毒现象，亚硝酸盐和硝酸盐可能会生成致癌的亚硝胺。而天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。因此，近年来，天然防腐剂的研究和开发利用成了食品工业的一个热点。
1.1溶菌酶
1.1.1溶菌酶研究历史和现状
人们对溶菌酶的研究始于本世纪初，英国细菌学家弗莱明(Fleming)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入，发现溶菌酶不仅有溶解细菌细胞壁的种类，还有作用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更进一步的了解。
1.1.2溶菌酶的性质
溶菌酶是一种化学性质十分稳定的蛋白，，在于燥条件下可在室温下长期保存，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。在ph1.2~11.3范围内，几乎不发生结构变化；对热极为稳定，在ph4~7,100oC处理1min基本保持酶原有活性。在酸性条件下是稳定的，此时100oC的加热处理使溶菌酶仅有很小的活性损失。
1.1.3溶菌酶的抑菌特性
溶菌酶对微生物的作用是其最主要的功能。
蛋清中的溶菌酶主要对G+菌最敏感，最敏感的是小球菌.枯草杆菌`巨大芽孢杆菌等。有些革兰氏阴性菌对酶有抵抗性。
溶菌酶对一些酵母菌也有抑制作用。许多酵母在低pH条件下产生气体.乙醇.和其他食品中不希望产生的物质导致食品的腐败，某些酵母对人类而言是致命的，溶菌酶对其有较好的抑制作用。
1．2溶菌酶的提取方法
溶菌酶是一种无毒无害的蛋白质，经研究表明和临床证实，溶菌酶具有杀菌、消炎、抗感染、消肿、增强免疫机能等作用，在食品中是一种天然安全性很高的食品保鲜剂，广泛应用于食品中。因此它是一种非常有希望的天然食品防腐剂，下面简单介绍一下溶菌酶在食品中应用的优势和缺点:
1）溶菌酶有非常高的热稳定性.鸡蛋清溶菌酶,是已知对热加工最稳定的酶之一,在pH4~5时,可在100摄氏度下保持活性1~2分钟,但随着pH的升高,其变性温度降低,而在缓冲体系中则表现很强的耐热性.但是在一些食品,特别是蛋白含量高的食品中,其热稳定性会下降,因为在加热时,溶菌酶会通过和其他蛋白形成二硫键产生共聚物而失去活性(Natoshi等,1991).
2）溶菌酶不会因为有机溶剂处理而失活,当转移回水溶液时,溶菌酶可恢复全部活性.
3）溶菌酶被冷冻或干燥处理时,活力稳定.
4）溶菌酶生产成本较低,鸡蛋清中溶菌酶约占总蛋清蛋白的3.5%.
5）溶菌酶适宜pH5.3~6.4,可用于酸性食品的防腐.
6）溶菌酶具有广泛的抗菌图谱,但主要局限于G+菌,对绝大多数G-没有抑制能力.
7）溶菌酶作为防腐剂安全性高，且在1992年FAO/WTO食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。
1.3溶菌酶在食品中的应用
1.3.1溶菌酶在乳制品中的应用
人们对溶菌酶添加于干酪等乳制品中的影响进行了广泛的研究，研究表明了溶菌酶加入乳中类似于凝乳酶，引起酪蛋白的降解。在鲜奶或奶粉中添加溶菌酶可起到许多药理和保健作用。
1.3.2溶菌酶在肉制品中的应用，溶菌酶可以对肉制品起防腐作用。
1.3.3溶菌酶在其他食品中的应用
在糕点中应用溶菌酶，可防止微生物的繁殖。在清酒中应用溶菌酶，以防止酸菌的繁殖。
2、材料与方法
2．1材料与方法
溶菌酶标准品(纯度99.99%);D152酸性阳离子交换树脂;干酪素;NaCl;NaOH;双缩脲试剂;以上化学药品均为分析纯蒸馏水校制;
2．2仪器
HD-21CA型核酸蛋白检测仪；HL-12恒流泵；BSZX系列自动部分收集器；色谱信号采集单元；TH-300梯度混合器；754型紫外可见光分光光度计；电脑一台
3、试验方法
3.1标准品的加样洗脱
Na型树脂75mL高27.7cm,液面高0.9，流速0.45mL/min,配制标准品溶液0.1g/100mL，取1mL,加样洗脱，洗脱液浓度分别为5%.10%.15%NaCl,洗脱三次。
3.2树脂吸附法提取溶菌酶的工艺研究
3.2.1树脂吸附法提取溶菌酶的工艺流程设计
本实验采用树脂吸附法提取溶菌酶，以鸡蛋为原料，通过搅拌吸附，上柱洗脱的方式分离鸡蛋白中的溶菌酶，现确定工艺路线如下：
新鲜鸡蛋→前处理→打蛋取蛋清→过滤→搅拌吸附→静置过夜→装柱上洗脱液→收集吸附液
3.2.2树脂的预处理
取一定量的D152型弱酸树脂，用清水，以流速不大于10m/h进行正洗和反洗，以达到去除杂质的目的。
6%NaOH处理：以树脂体积两倍的6%氨水，浸泡24h.体积膨胀2倍左右。用清水细至PH8-12,体积不变，加热后仍不变。
5%HCl处理：以树脂体积4倍的5%HCl溶液，浸泡24h.体积缩小为原体积。然后用清水洗至PH4-5.浸泡24h.
3.2.2搅拌树脂的制备
将10枚用水洗净,破壳取出蛋清，用两层纱布过滤三次,搅拌均质,将滤得的蛋清和已经预处理的树脂以2；1的比例混合，搅拌3小时，过滤,在5-7°C的温度下静置12h,装柱25cm液面高1cm,静置30min,将0.5%NaCl洗脱液装入梯度混合器中,对杂蛋白进行洗脱.等待色谱曲线升高再降至基线,用烧杯收集,马上换浓度高的洗脱液,换另一个锥形瓶收集.
3.2.3蛋白质浓度标准曲线的制作
取12个试管分成两组，分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准酪蛋白溶液，用水补足到2毫升，然后各加入4毫升双缩脲试剂，充分摇匀后，在室温下（20—25℃）放置30分钟，于540nm处进行比色测定。取两组测定的平均值，以酪蛋白的含量为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，做为定量的依据。
3.2.3.1酶蛋白含量的测定
取2支试管分别加入溶菌酶的样品溶液1ml，用水补足到2毫升然后各加入4毫升双缩脲试剂，方法同上，得的样品的OD值，查标准曲线即得到蛋白质的浓度。
4、结果与讨论
4．1结果
4.1.1蛋白质浓度标准曲线
[关键词] 鸡蛋清 溶菌酶 提取 层析柱法
1、序言：
溶菌酶（lysozyme.Lz）又称胞壁质酶(Nicolle)或N一乙酸胞壁質聚糖水解酶（N-Acetyl-muramide glycan hrdrlase），溶菌酶是一种碱性球蛋白,广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中.哺乳动物的唾液,眼泪,尿,血浆及某些植物如萝卜,卷心菜中都含有溶菌酶.蛋白中溶菌酶含量最丰富鸡,占蛋清总蛋白的3.4％～3.5％，溶菌酶在食品中也有广泛的应用。可以将溶菌酶加在鲜牛奶或奶粉中,以增强食用牛奶和奶粉的婴儿的免疫力。也可以加入到西点、饮品、肉制品中,作为防腐剂以延长产品保质期，近年来，全世界农副产品、水产品、果蔬等食品腐烂变质而引起的经济损失十分巨大。如何防止食品的腐败变质越来越引起人们的重视，有关食品防腐剂的研究也日趋完善，食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂，过去，人们大都使用合成防腐剂，但经长期的研究发现一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题，如苯甲酸盐可能会引起食物中毒现象，亚硝酸盐和硝酸盐可能会生成致癌的亚硝胺。而天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。因此，近年来，天然防腐剂的研究和开发利用成了食品工业的一个热点。
1.1溶菌酶
1.1.1溶菌酶研究历史和现状
人们对溶菌酶的研究始于本世纪初，英国细菌学家弗莱明(Fleming)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入，发现溶菌酶不仅有溶解细菌细胞壁的种类，还有作用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更进一步的了解。
1.1.2溶菌酶的性质
溶菌酶是一种化学性质十分稳定的蛋白，，在于燥条件下可在室温下长期保存，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。在ph1.2~11.3范围内，几乎不发生结构变化；对热极为稳定，在ph4~7,100oC处理1min基本保持酶原有活性。在酸性条件下是稳定的，此时100oC的加热处理使溶菌酶仅有很小的活性损失。
1.1.3溶菌酶的抑菌特性
溶菌酶对微生物的作用是其最主要的功能。
蛋清中的溶菌酶主要对G+菌最敏感，最敏感的是小球菌.枯草杆菌`巨大芽孢杆菌等。有些革兰氏阴性菌对酶有抵抗性。
溶菌酶对一些酵母菌也有抑制作用。许多酵母在低pH条件下产生气体.乙醇.和其他食品中不希望产生的物质导致食品的腐败，某些酵母对人类而言是致命的，溶菌酶对其有较好的抑制作用。
1．2溶菌酶的提取方法
溶菌酶是一种无毒无害的蛋白质，经研究表明和临床证实，溶菌酶具有杀菌、消炎、抗感染、消肿、增强免疫机能等作用，在食品中是一种天然安全性很高的食品保鲜剂，广泛应用于食品中。因此它是一种非常有希望的天然食品防腐剂，下面简单介绍一下溶菌酶在食品中应用的优势和缺点:
1）溶菌酶有非常高的热稳定性.鸡蛋清溶菌酶,是已知对热加工最稳定的酶之一,在pH4~5时,可在100摄氏度下保持活性1~2分钟,但随着pH的升高,其变性温度降低,而在缓冲体系中则表现很强的耐热性.但是在一些食品,特别是蛋白含量高的食品中,其热稳定性会下降,因为在加热时,溶菌酶会通过和其他蛋白形成二硫键产生共聚物而失去活性(Natoshi等,1991).
2）溶菌酶不会因为有机溶剂处理而失活,当转移回水溶液时,溶菌酶可恢复全部活性.
3）溶菌酶被冷冻或干燥处理时,活力稳定.
4）溶菌酶生产成本较低,鸡蛋清中溶菌酶约占总蛋清蛋白的3.5%.
5）溶菌酶适宜pH5.3~6.4,可用于酸性食品的防腐.
6）溶菌酶具有广泛的抗菌图谱,但主要局限于G+菌,对绝大多数G-没有抑制能力.
7）溶菌酶作为防腐剂安全性高，且在1992年FAO/WTO食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。
1.3溶菌酶在食品中的应用
1.3.1溶菌酶在乳制品中的应用
人们对溶菌酶添加于干酪等乳制品中的影响进行了广泛的研究，研究表明了溶菌酶加入乳中类似于凝乳酶，引起酪蛋白的降解。在鲜奶或奶粉中添加溶菌酶可起到许多药理和保健作用。
1.3.2溶菌酶在肉制品中的应用，溶菌酶可以对肉制品起防腐作用。
1.3.3溶菌酶在其他食品中的应用
在糕点中应用溶菌酶，可防止微生物的繁殖。在清酒中应用溶菌酶，以防止酸菌的繁殖。
2、材料与方法
2．1材料与方法
溶菌酶标准品(纯度99.99%);D152酸性阳离子交换树脂;干酪素;NaCl;NaOH;双缩脲试剂;以上化学药品均为分析纯蒸馏水校制;
2．2仪器
HD-21CA型核酸蛋白检测仪；HL-12恒流泵；BSZX系列自动部分收集器；色谱信号采集单元；TH-300梯度混合器；754型紫外可见光分光光度计；电脑一台
3、试验方法
3.1标准品的加样洗脱
Na型树脂75mL高27.7cm,液面高0.9，流速0.45mL/min,配制标准品溶液0.1g/100mL，取1mL,加样洗脱，洗脱液浓度分别为5%.10%.15%NaCl,洗脱三次。
3.2树脂吸附法提取溶菌酶的工艺研究
3.2.1树脂吸附法提取溶菌酶的工艺流程设计
本实验采用树脂吸附法提取溶菌酶，以鸡蛋为原料，通过搅拌吸附，上柱洗脱的方式分离鸡蛋白中的溶菌酶，现确定工艺路线如下：
新鲜鸡蛋→前处理→打蛋取蛋清→过滤→搅拌吸附→静置过夜→装柱上洗脱液→收集吸附液
3.2.2树脂的预处理
取一定量的D152型弱酸树脂，用清水，以流速不大于10m/h进行正洗和反洗，以达到去除杂质的目的。
6%NaOH处理：以树脂体积两倍的6%氨水，浸泡24h.体积膨胀2倍左右。用清水细至PH8-12,体积不变，加热后仍不变。
5%HCl处理：以树脂体积4倍的5%HCl溶液，浸泡24h.体积缩小为原体积。然后用清水洗至PH4-5.浸泡24h.
3.2.2搅拌树脂的制备
将10枚用水洗净,破壳取出蛋清，用两层纱布过滤三次,搅拌均质,将滤得的蛋清和已经预处理的树脂以2；1的比例混合，搅拌3小时，过滤,在5-7°C的温度下静置12h,装柱25cm液面高1cm,静置30min,将0.5%NaCl洗脱液装入梯度混合器中,对杂蛋白进行洗脱.等待色谱曲线升高再降至基线,用烧杯收集,马上换浓度高的洗脱液,换另一个锥形瓶收集.
3.2.3蛋白质浓度标准曲线的制作
取12个试管分成两组，分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准酪蛋白溶液，用水补足到2毫升，然后各加入4毫升双缩脲试剂，充分摇匀后，在室温下（20—25℃）放置30分钟，于540nm处进行比色测定。取两组测定的平均值，以酪蛋白的含量为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，做为定量的依据。
3.2.3.1酶蛋白含量的测定
取2支试管分别加入溶菌酶的样品溶液1ml，用水补足到2毫升然后各加入4毫升双缩脲试剂，方法同上，得的样品的OD值，查标准曲线即得到蛋白质的浓度。
4、结果与讨论
4．1结果
4.1.1蛋白质浓度标准曲线