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摘 要：目的 探讨黄秦艽中活性成分D1对雪上一枝蒿总生物碱（CFA）所致的PC12细胞损伤的保护作用及机制。方法 用噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞活力，试剂盒测定乳酸脱氢酶（LDH）活力，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Bcl-2表达水平。结果 CFA孵育24 h可劑量依赖性降低PC12细胞存活率。D1（6.25～25 μg/mL） 预孵育2 h可显著抑制CFA所致的PC12细胞损伤和LDH释放，当D1浓度为6.25 μg/mL和25 μg/mL时，Bcl-2蛋白表达水平明显上升。结论 D1可通过修复损伤的线粒体及调节相应凋亡蛋白表达保护CFA所致的PC12损伤。
关键词：雪上一枝蒿 黄秦艽 神经细胞 毒性 保护
中图分类号：R742.4 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）05（a）-0246-02
雪上一枝蒿是毛茛科乌头属（Aconitum）植物短柄乌头的干燥块根，又名铁棒锤，临床上用来治疗风寒湿痹所致的筋骨和关节疼痛、跌打损伤所致的瘀血疼痛等[1]。常见误用、滥用中毒致死的情况[2]。
龙胆科黄秦艽属植物黄秦艽（Veratrilla baillonii），是云南地方习用中草药，具有清热解毒功效[3]。该文旨在通过观察黄秦艽中活性成分D1对雪上一枝蒿总生物碱（CFA）所致的PC12细胞损伤的影响，初步评价其对CFA所致神经细胞毒性的保护作用及机制。
1 仪器与材料
1.1 仪器
354型全自动酶标仪，上海Thermo公司制造；DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪，北京六一公司制造。
1.2 药物与试剂
龙胆苦苷（批号：20150614）与獐芽菜苷（批号：20150702）标准品购自上海原叶公司；噻唑蓝（MTT，批号：20150321，Sigma公司）；LDH试剂盒（批号：A020-2，南京建成公司）；BCA试剂盒（批号：P0012S，北京普利莱公司）；β-actin（批号：20150610）和Bcl-2抗体（批号：20150522）购自Cell Signal公司；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 活性成分检测方法
黄秦艽购自云南大理，其活性成分D1由该实验室制备。供试品及单体对照品用甲醇溶解滤过。检测条件：Thermo Scientific Syncronis C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为28%乙腈-水，柱温为30℃，进样量10 μL，流速1 mL /min，检测结果显示，黄秦艽活性成分D1为龙胆苦苷与獐芽菜苷的混合物。
2.1.2 药物预处理方法
将PC12细胞接种于96孔板中。（1）不同浓度（6.25～25 μg/ml）的D1单独孵育24 h。（2）CFA 100 μg/mL孵育24 h。（3）不同浓度（6.25～25 μg/mL）的D1预孵育2 h后，再用CFA 100 μg/mL孵育24 h。
2.1.3 MTT法测定细胞活力
细胞加入MTT 使之终浓度为0.5 mg/mL，37 ℃继续培养4 h 后，加入150 μL DMSO溶解，震荡后于酶标仪570 nm处检测OD值，计算细胞存活率。
细胞存活率=（给药组OD570值/空白对照组OD570值）×100%。
2.1.4 LDH活性检测
药物处理后，取上清，按照试剂盒说明书进行LDH活性检测。
2.1.5 Western blot免疫印迹法检测Bcl-2表达水平
提取细胞总蛋白并测定浓度。电泳、转膜。再用5%脱脂奶粉封闭1 h。洗膜，加入目的一抗置于冰盒摇床震荡过夜。次日，回收一抗，加入过氧化物酶标记羊抗兔IgG震荡2 h。洗膜后凝胶成像系统拍照。以β- actin作为内参。
2.1.6 统计学处理
以来表示实验数据，用SPSS 18.0软件，ANOVA法比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2.2 结果
2.2.1 D1对PC12细胞及染毒PC12细胞活力的影响
图1A显示，CFA孵育24 h后可剂量依赖性降低细胞存活率，各浓度D1对细胞存活率则无明显影响（见图1B）；D1（6.25～25 μg/mL）预孵育2 h可减轻CFA所致的细胞存活率明显下降（见图1C）和LDH 释放增高（见图1D）。
2.2.2 D1对染毒PC12细胞表达Bcl-2的影响
如图2所示，与空白对照组相比，染毒组中Bcl-2蛋白表达水平明显下降；6.25～25 μg/mL 的D1使Bcl-2蛋白表达水平明显上升。
3 讨论
乌头类神经毒性可能与神经递质紊乱有关。LDH大量存在于神经元的胞质和线粒体中，当脑细胞缺血缺氧时，乳酸脱氢酶通过受损的血-脑脊液屏障进入血液。Bcl-2基因表达产物可通过抗氧化，抑制线粒体细胞色素C释放，抑制促凋亡基因的作用来抑制细胞凋亡。
该实验结果显示，黄秦艽中的活性组分D1可降低CFA引起的细胞凋亡与坏死，其作用机制与减少细胞LDH释放，抑制凋亡相关基因Bcl-2，进而修复CFA所致的线粒体损伤等有关。
参考文献
[1] 黄先菊，胡超，苏慧娟，等.铁棒锤氯仿部位的毒-效关系研究[J].中南民族大学学报：自然科学版，2014，33（3）：53-56.
[2] 陈芙蓉，邹大江，闪仁龙，等.近10年含乌头碱类植物中毒原因及解毒办法文献分析[J].时珍国医国药，2012，23（12）：3116-3118.
[3] 贾敏如，李星炜.中国民族药志要[M].北京：中国医药科技出版社，2005：182.
关键词：雪上一枝蒿 黄秦艽 神经细胞 毒性 保护
中图分类号：R742.4 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）05（a）-0246-02
雪上一枝蒿是毛茛科乌头属（Aconitum）植物短柄乌头的干燥块根，又名铁棒锤，临床上用来治疗风寒湿痹所致的筋骨和关节疼痛、跌打损伤所致的瘀血疼痛等[1]。常见误用、滥用中毒致死的情况[2]。
龙胆科黄秦艽属植物黄秦艽（Veratrilla baillonii），是云南地方习用中草药，具有清热解毒功效[3]。该文旨在通过观察黄秦艽中活性成分D1对雪上一枝蒿总生物碱（CFA）所致的PC12细胞损伤的影响，初步评价其对CFA所致神经细胞毒性的保护作用及机制。
1 仪器与材料
1.1 仪器
354型全自动酶标仪，上海Thermo公司制造；DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪，北京六一公司制造。
1.2 药物与试剂
龙胆苦苷（批号：20150614）与獐芽菜苷（批号：20150702）标准品购自上海原叶公司；噻唑蓝（MTT，批号：20150321，Sigma公司）；LDH试剂盒（批号：A020-2，南京建成公司）；BCA试剂盒（批号：P0012S，北京普利莱公司）；β-actin（批号：20150610）和Bcl-2抗体（批号：20150522）购自Cell Signal公司；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 活性成分检测方法
黄秦艽购自云南大理，其活性成分D1由该实验室制备。供试品及单体对照品用甲醇溶解滤过。检测条件：Thermo Scientific Syncronis C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为28%乙腈-水，柱温为30℃，进样量10 μL，流速1 mL /min，检测结果显示，黄秦艽活性成分D1为龙胆苦苷与獐芽菜苷的混合物。
2.1.2 药物预处理方法
将PC12细胞接种于96孔板中。（1）不同浓度（6.25～25 μg/ml）的D1单独孵育24 h。（2）CFA 100 μg/mL孵育24 h。（3）不同浓度（6.25～25 μg/mL）的D1预孵育2 h后，再用CFA 100 μg/mL孵育24 h。
2.1.3 MTT法测定细胞活力
细胞加入MTT 使之终浓度为0.5 mg/mL，37 ℃继续培养4 h 后，加入150 μL DMSO溶解，震荡后于酶标仪570 nm处检测OD值，计算细胞存活率。
细胞存活率=（给药组OD570值/空白对照组OD570值）×100%。
2.1.4 LDH活性检测
药物处理后，取上清，按照试剂盒说明书进行LDH活性检测。
2.1.5 Western blot免疫印迹法检测Bcl-2表达水平
提取细胞总蛋白并测定浓度。电泳、转膜。再用5%脱脂奶粉封闭1 h。洗膜，加入目的一抗置于冰盒摇床震荡过夜。次日，回收一抗，加入过氧化物酶标记羊抗兔IgG震荡2 h。洗膜后凝胶成像系统拍照。以β- actin作为内参。
2.1.6 统计学处理
以来表示实验数据，用SPSS 18.0软件，ANOVA法比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2.2 结果
2.2.1 D1对PC12细胞及染毒PC12细胞活力的影响
图1A显示，CFA孵育24 h后可剂量依赖性降低细胞存活率，各浓度D1对细胞存活率则无明显影响（见图1B）；D1（6.25～25 μg/mL）预孵育2 h可减轻CFA所致的细胞存活率明显下降（见图1C）和LDH 释放增高（见图1D）。
2.2.2 D1对染毒PC12细胞表达Bcl-2的影响
如图2所示，与空白对照组相比，染毒组中Bcl-2蛋白表达水平明显下降；6.25～25 μg/mL 的D1使Bcl-2蛋白表达水平明显上升。
3 讨论
乌头类神经毒性可能与神经递质紊乱有关。LDH大量存在于神经元的胞质和线粒体中，当脑细胞缺血缺氧时，乳酸脱氢酶通过受损的血-脑脊液屏障进入血液。Bcl-2基因表达产物可通过抗氧化，抑制线粒体细胞色素C释放，抑制促凋亡基因的作用来抑制细胞凋亡。
该实验结果显示，黄秦艽中的活性组分D1可降低CFA引起的细胞凋亡与坏死，其作用机制与减少细胞LDH释放，抑制凋亡相关基因Bcl-2，进而修复CFA所致的线粒体损伤等有关。
参考文献
[1] 黄先菊，胡超，苏慧娟，等.铁棒锤氯仿部位的毒-效关系研究[J].中南民族大学学报：自然科学版，2014，33（3）：53-56.
[2] 陈芙蓉，邹大江，闪仁龙，等.近10年含乌头碱类植物中毒原因及解毒办法文献分析[J].时珍国医国药，2012，23（12）：3116-3118.
[3] 贾敏如，李星炜.中国民族药志要[M].北京：中国医药科技出版社，2005：182.