论文部分内容阅读
木芙蓉属锦葵科木槿属小乔木，在我国南方很常见，其花大、色艳，观赏价值高。《本草纲目》言其“治一切大小痈疽，肿毒恶疮，消肿，排脓，止痛”。我查阅CNKI数据库发现，研究木芙蓉抑菌作用的文献很少，只发现李昌灵老师对木芙蓉叶提取物的抑菌作用进行过研究。研究木芙蓉花抑菌效果的文献则没有。
金黄色葡萄球菌是化脓感染中最常见的病原菌，可引起青春痘的化脓感染。受李昌灵老师的研究启发，我进行了木芙蓉花70% 乙醇提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果的探究。
一、实验材料与仪器
木芙蓉花，乙醇（国产分析纯），金黄色葡萄球菌，LB 固体培养基，LB 液体培养基。
立式压力蒸汽灭菌器，摇床，电热恒温培养箱，水平层流净化工作台，旋转蒸发器（RE-52AA），JY92-IIN超声波细胞粉碎机。
二、实验过程
1.制备木芙蓉花70%乙醇提取液
将新鲜的木芙蓉花用水洗净，烘干、粉碎，取20g木芙蓉花干粉，加入200mL70%乙醇，进行超声波细胞粉碎，使所得滤液温度保持在65℃，利用旋转蒸发器浓缩，用容量瓶定容至浓度为1g/mL。灭菌20min后，放入冰箱，在4℃的环境下冷藏。
2.制备菌悬液
在无菌条件下，将37℃活化后的金黄色葡萄球菌取出，采用麦氏比浊法制备108cfu/mL菌懸液，再稀释为106cuf/mL的菌悬液。
3.琼脂打孔法
在无菌条件下，取106cfu/mL的金黄色葡萄球菌悬液100uL，涂布于LB固体培养基，用灭菌的50uL的移液枪枪头在灭菌的LB 固体培养基上打孔，并挑出孔内的培养基，每个培养皿打4个孔。其中3个孔注入灭菌的1g/mL木芙蓉花70%乙醇提取液，另一个孔注入1%链霉素作为阴性对照。
同时，4个孔液面上放入灭菌的打孔滤纸圆片，置于37℃恒温培养箱中培养24h，重复3次，测定抑菌圈半径（为孔边缘至相对应的透明圈的最外缘间的环形距离）。
4.二倍稀释法
在无菌条件下，取8支试管，分别注入1mL的LB液体培养基，采用二倍稀释法，将浓度为1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液分别稀释，得到浓度为1g/mL，0.5g/mL，0.25g/mL，
0.125g/mL，0.0 625g/mL，0.03 125g/mL的药液，编号1～6，每支试管都含有 1mL的不同稀释度药液。取剩余的2支试管中的1支加入0.03mL1% 链霉素作阴性对照，另1支不加，作阳性对照。
在上述8支试管中各接种100uL 106cfu/mL金黄色葡萄球菌悬液，置于37℃恒温箱中培养24h，观察其生长情况。
三、结果与分析
1.琼脂打孔法实验结果
根据琼脂打孔法进行实验，分析1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌透明圈。
1号、2号、3号孔注入的是1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液，浅棕色表明木芙蓉花提取液渗透至固体培养基中，浅棕色区域因提取液渐次渗透，所以有菌长出。孔边缘的深棕色为抑菌透明圈，透明圈区域无菌落长出，其最大抑菌圈半径是10mm，最小抑菌圈1mm，众数是3mm。
4号孔注入的是1%链霉素，孔四周透明，无菌长出，表明链霉素有较强的抑菌效果，如图 1所示。实验结果表明，1g/mL的木芙蓉花70% 乙醇提取液对金黄色葡萄球菌有抑制作用。
2.二倍稀释法实验结果
琼脂打孔法的抑菌实验结果表明，1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液对金黄色葡萄球菌有抑制作用。在此基础上采用二倍稀释法进行定量实验，以进一步了解其最低抑菌浓度（MIC），实验现象见图2。
培养24h后，振荡1号至5号试管培养液后无混浊现象，说明无菌长出。振荡6号试管后轻微混浊，说明有菌长出。阳性对照试管菌液明显混浊，阴性对照试管中加入的是1% 链霉素，振荡培养液后仍澄清，说明无菌长出。
初步判断，木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.0 625g/mL。再将5号试管培养物取100uL涂布于固体LB培养基中，置于37℃恒温箱中培养24h后，平板上无菌落出现。
综上结果可确定，木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.0 625g/mL。详细结果如表 1所示。
四、实验讨论
李昌灵老师对木芙蓉叶提取物的抑菌作用进行过研究，其数据表明，木芙蓉叶70%乙醇提取物抑制金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.5g/mL。本实验参照李昌灵老师实验中定性研究的方法，得到木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.0 625g/mL。
琼脂打孔法操作简便，可作为筛选抑菌效果的定性方法。实验过程中考虑到培养过程中药液会蒸发，所以盖上纸片，既可减缓液体的蒸发，又可减少液体流入固体培养基底部。
二倍稀释法是一种精确定量的方法，但操作复杂。另外，实验提取所得的药液为颜色较深的中草药制剂，若直接根据培养液的混浊度来判断最低抑菌浓度（MIC），可能会因为颜色深而导致观察不准确。在这之后将含最低浓度提取液的澄清液体培养基用涂平板的方法继续培养24h，根据最终是否有菌落长出则能较好地避免这种现象，确定最低抑菌浓度（MIC）。
本文利用木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行了实验，为研究木芙蓉花的解毒、消肿、排毒功效提供了初步的实验依据。但还未对其他常见病原菌的抑菌效果进行研究，今后可进一步探究。
金黄色葡萄球菌是化脓感染中最常见的病原菌，可引起青春痘的化脓感染。受李昌灵老师的研究启发，我进行了木芙蓉花70% 乙醇提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果的探究。
一、实验材料与仪器
木芙蓉花，乙醇（国产分析纯），金黄色葡萄球菌，LB 固体培养基，LB 液体培养基。
立式压力蒸汽灭菌器，摇床，电热恒温培养箱，水平层流净化工作台，旋转蒸发器（RE-52AA），JY92-IIN超声波细胞粉碎机。
二、实验过程
1.制备木芙蓉花70%乙醇提取液
将新鲜的木芙蓉花用水洗净，烘干、粉碎，取20g木芙蓉花干粉，加入200mL70%乙醇，进行超声波细胞粉碎，使所得滤液温度保持在65℃，利用旋转蒸发器浓缩，用容量瓶定容至浓度为1g/mL。灭菌20min后，放入冰箱，在4℃的环境下冷藏。
2.制备菌悬液
在无菌条件下，将37℃活化后的金黄色葡萄球菌取出，采用麦氏比浊法制备108cfu/mL菌懸液，再稀释为106cuf/mL的菌悬液。
3.琼脂打孔法
在无菌条件下，取106cfu/mL的金黄色葡萄球菌悬液100uL，涂布于LB固体培养基，用灭菌的50uL的移液枪枪头在灭菌的LB 固体培养基上打孔，并挑出孔内的培养基，每个培养皿打4个孔。其中3个孔注入灭菌的1g/mL木芙蓉花70%乙醇提取液，另一个孔注入1%链霉素作为阴性对照。
同时，4个孔液面上放入灭菌的打孔滤纸圆片，置于37℃恒温培养箱中培养24h，重复3次，测定抑菌圈半径（为孔边缘至相对应的透明圈的最外缘间的环形距离）。
4.二倍稀释法
在无菌条件下，取8支试管，分别注入1mL的LB液体培养基，采用二倍稀释法，将浓度为1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液分别稀释，得到浓度为1g/mL，0.5g/mL，0.25g/mL，
0.125g/mL，0.0 625g/mL，0.03 125g/mL的药液，编号1～6，每支试管都含有 1mL的不同稀释度药液。取剩余的2支试管中的1支加入0.03mL1% 链霉素作阴性对照，另1支不加，作阳性对照。
在上述8支试管中各接种100uL 106cfu/mL金黄色葡萄球菌悬液，置于37℃恒温箱中培养24h，观察其生长情况。
三、结果与分析
1.琼脂打孔法实验结果
根据琼脂打孔法进行实验，分析1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌透明圈。
1号、2号、3号孔注入的是1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液，浅棕色表明木芙蓉花提取液渗透至固体培养基中，浅棕色区域因提取液渐次渗透，所以有菌长出。孔边缘的深棕色为抑菌透明圈，透明圈区域无菌落长出，其最大抑菌圈半径是10mm，最小抑菌圈1mm，众数是3mm。
4号孔注入的是1%链霉素，孔四周透明，无菌长出，表明链霉素有较强的抑菌效果，如图 1所示。实验结果表明，1g/mL的木芙蓉花70% 乙醇提取液对金黄色葡萄球菌有抑制作用。
2.二倍稀释法实验结果
琼脂打孔法的抑菌实验结果表明，1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液对金黄色葡萄球菌有抑制作用。在此基础上采用二倍稀释法进行定量实验，以进一步了解其最低抑菌浓度（MIC），实验现象见图2。
培养24h后，振荡1号至5号试管培养液后无混浊现象，说明无菌长出。振荡6号试管后轻微混浊，说明有菌长出。阳性对照试管菌液明显混浊，阴性对照试管中加入的是1% 链霉素，振荡培养液后仍澄清，说明无菌长出。
初步判断，木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.0 625g/mL。再将5号试管培养物取100uL涂布于固体LB培养基中，置于37℃恒温箱中培养24h后，平板上无菌落出现。
综上结果可确定，木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.0 625g/mL。详细结果如表 1所示。
四、实验讨论
李昌灵老师对木芙蓉叶提取物的抑菌作用进行过研究，其数据表明，木芙蓉叶70%乙醇提取物抑制金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.5g/mL。本实验参照李昌灵老师实验中定性研究的方法，得到木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为0.0 625g/mL。
琼脂打孔法操作简便，可作为筛选抑菌效果的定性方法。实验过程中考虑到培养过程中药液会蒸发，所以盖上纸片，既可减缓液体的蒸发，又可减少液体流入固体培养基底部。
二倍稀释法是一种精确定量的方法，但操作复杂。另外，实验提取所得的药液为颜色较深的中草药制剂，若直接根据培养液的混浊度来判断最低抑菌浓度（MIC），可能会因为颜色深而导致观察不准确。在这之后将含最低浓度提取液的澄清液体培养基用涂平板的方法继续培养24h，根据最终是否有菌落长出则能较好地避免这种现象，确定最低抑菌浓度（MIC）。
本文利用木芙蓉花70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行了实验，为研究木芙蓉花的解毒、消肿、排毒功效提供了初步的实验依据。但还未对其他常见病原菌的抑菌效果进行研究，今后可进一步探究。