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摘要：目的 建立凉血解毒胶囊中芍药苷的高效液相色谱含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法对凉血解毒胶囊中的芍药苷含量进行测定。色谱柱：Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-0.1%醋酸水（25∶75）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm。结果 芍药苷在进样量0.030 36～0.485 8 ?g范围内线性关系良好，r=0.999 98，平均加样回收率101.2%，RSD=2.4%（n=6）。结论 本方法简便快捷，适于该制剂的质量控制。
关键词：芍药苷；高效液相色谱法；凉血解毒胶囊；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.023
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0060-02
涼血解毒胶囊为北京市朝阳区双安医院院内制剂，是由羚羊角、牡丹皮、赤芍等多味药材制成的中药复方制剂，具有清热凉血、解毒宁心功效，用于血热毒热引起的皮肤病重症，如红皮症、系统性红斑狼疮急性期、银屑病急性期、急性湿疹、过敏性皮炎等。该制剂已有胶囊性状、薄层鉴别等质量控制项目，但未对主要成分的含量进行控制，本试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定凉血解毒胶囊中芍药苷的含量，以提高其质量标准。现报道如下。
1 仪器与试药
美国Agilent1200高效液相色谱仪：G1311A四元泵， G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，Agilent chemstation化学工作站。赛多利斯arium?61316/611VF超纯水处理器，赛多利斯 BT25S、BT423S分析天平。电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司。离心机，Anke TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂。
芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号110736-200732）。3批凉血解毒胶囊均由北京市朝阳区双安医院提供，批号100401、100402、100403。甲醇、乙酸为色谱纯 （北京迪科马科技有限公司），无水乙醇为分析纯（北京化工厂），超纯水为自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-0.1%醋酸水（25∶75）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm；进样量：10 ?L。
2.2 对照品溶液制备
称取芍药苷对照品适量，精密称定，于5 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂定容，制成每1 mL含芍药苷4.858 mg的储备溶液，备用。
2.3 供试品溶液的制备
取胶囊内容物0.1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入无水乙醇20 mL，称重，回流提取20 min，放至室温，补足减失的重量，4 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液1 mL至10 mL容量瓶中，以流动相定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方比例取除赤芍、牡丹皮外的其他药材，以相同工艺制备，按“2.3”项下方法制成缺牡丹皮、赤芍的阴性对照溶液。
2.5 专属性试验
取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。供试品色谱图中，在与对照品相应的位置上，有一相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无干扰，见图1。
2.6 线性关系考察
精密吸取芍药苷对照品储备溶液适量，以流动相为溶剂，配制系列浓度为3.036、6.072 5、12.145、24.29、48.58 ?g/mL的芍药苷对照品溶液，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y= 1 234.93X+3.89，r=0.999 98。芍药苷线性范围0.030 36～0.485 8 ?g。
2.7 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10 ?L，在所确定的色谱条件下，重复进样6次，求得峰面积平均值为175.9，RSD=1.9%，表明精密度良好。
2.8 稳定性考察
精密吸取同一供试品溶液10 ?L，分别于0、2、4、6、8、24 h依次进样，测得芍药苷的峰面积平均值RSD=0.4%，表明样品在24 h内稳定。
2.9 重复性试验
取同一批样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在所确定的色谱条件下进行测定，以外标一点法计算样品含量，结果平均含量25.49 mg/g，RSD=1.5%，表明方法重复性良好。
2.10 加样回收率试验
采用加样回收法，称取6份已知含量同一批号（含芍药苷25.49 mg/g）样品各0.1 g，精密称定。分别加入芍药苷对照品适量，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，计算回收率[1]。结果见表1。
3 讨论
芍药苷为牡丹皮及赤芍的主要成分，故选用芍药苷的含量来控制该制剂的质量。曾尝试以多成分含量测定控制该制剂的质量，方中含牡丹皮的主要成分还有丹皮酚[1-2]，对凉血解毒胶囊内容物采用无水乙醇超声提取的处理方法，未检出丹皮酚，故最后仍然以单一成分芍药苷的HPLC含量测定来控制该制剂的质量。
该方中的赤芍主要成分为芍药苷，用色谱柱Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 ?m），改变流动相0.1%醋酸水-甲醇比例（50∶50、60∶40、70∶30），观察不同条件下供试品芍药苷的色谱图，或芍药苷与干扰峰分离度不好，或芍药苷峰形不对称。更换色谱柱Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m），进一步考察流动相不同比例（70∶30、75∶25），芍药苷峰形对称且与干扰峰分离完全，最后确定最优色谱条件：Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m）色谱柱，0.1%醋酸水-甲醇（75∶25）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃。该方法测定凉血胶囊中芍药苷的含量专属性及重复性好，简单快速。
考察了回流提取与超声提取，超声提取测得供试品含量为19.263 4 mg/g，回流提取测得含量为25.056 4 mg/g，结果显示，回流提取效率明显高于超声提取。考察了回流提取的时间分别为20、30、45、50、60 min，提取效率无明显差异，故选择提取时间为20 min。
参考文献：
[1] 吴楠，张秀丽.HPLC法测定利心丸中丹皮酚的含量[J].中国药事， 2009，23（6）：568-570.
[2] 李娴，王本杰，郭瑞臣，等.六味地黄丸中四种活性成分的HPLC 法测定[J].中国医药工业杂志，2010，41（2）：126-128.
（收稿日期：2012-10-26，编辑：陈静）
关键词：芍药苷；高效液相色谱法；凉血解毒胶囊；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.023
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0060-02
涼血解毒胶囊为北京市朝阳区双安医院院内制剂，是由羚羊角、牡丹皮、赤芍等多味药材制成的中药复方制剂，具有清热凉血、解毒宁心功效，用于血热毒热引起的皮肤病重症，如红皮症、系统性红斑狼疮急性期、银屑病急性期、急性湿疹、过敏性皮炎等。该制剂已有胶囊性状、薄层鉴别等质量控制项目，但未对主要成分的含量进行控制，本试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定凉血解毒胶囊中芍药苷的含量，以提高其质量标准。现报道如下。
1 仪器与试药
美国Agilent1200高效液相色谱仪：G1311A四元泵， G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，Agilent chemstation化学工作站。赛多利斯arium?61316/611VF超纯水处理器，赛多利斯 BT25S、BT423S分析天平。电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司。离心机，Anke TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂。
芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号110736-200732）。3批凉血解毒胶囊均由北京市朝阳区双安医院提供，批号100401、100402、100403。甲醇、乙酸为色谱纯 （北京迪科马科技有限公司），无水乙醇为分析纯（北京化工厂），超纯水为自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-0.1%醋酸水（25∶75）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm；进样量：10 ?L。
2.2 对照品溶液制备
称取芍药苷对照品适量，精密称定，于5 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂定容，制成每1 mL含芍药苷4.858 mg的储备溶液，备用。
2.3 供试品溶液的制备
取胶囊内容物0.1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入无水乙醇20 mL，称重，回流提取20 min，放至室温，补足减失的重量，4 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液1 mL至10 mL容量瓶中，以流动相定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方比例取除赤芍、牡丹皮外的其他药材，以相同工艺制备，按“2.3”项下方法制成缺牡丹皮、赤芍的阴性对照溶液。
2.5 专属性试验
取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。供试品色谱图中，在与对照品相应的位置上，有一相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无干扰，见图1。
2.6 线性关系考察
精密吸取芍药苷对照品储备溶液适量，以流动相为溶剂，配制系列浓度为3.036、6.072 5、12.145、24.29、48.58 ?g/mL的芍药苷对照品溶液，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y= 1 234.93X+3.89，r=0.999 98。芍药苷线性范围0.030 36～0.485 8 ?g。
2.7 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10 ?L，在所确定的色谱条件下，重复进样6次，求得峰面积平均值为175.9，RSD=1.9%，表明精密度良好。
2.8 稳定性考察
精密吸取同一供试品溶液10 ?L，分别于0、2、4、6、8、24 h依次进样，测得芍药苷的峰面积平均值RSD=0.4%，表明样品在24 h内稳定。
2.9 重复性试验
取同一批样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在所确定的色谱条件下进行测定，以外标一点法计算样品含量，结果平均含量25.49 mg/g，RSD=1.5%，表明方法重复性良好。
2.10 加样回收率试验
采用加样回收法，称取6份已知含量同一批号（含芍药苷25.49 mg/g）样品各0.1 g，精密称定。分别加入芍药苷对照品适量，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，计算回收率[1]。结果见表1。
3 讨论
芍药苷为牡丹皮及赤芍的主要成分，故选用芍药苷的含量来控制该制剂的质量。曾尝试以多成分含量测定控制该制剂的质量，方中含牡丹皮的主要成分还有丹皮酚[1-2]，对凉血解毒胶囊内容物采用无水乙醇超声提取的处理方法，未检出丹皮酚，故最后仍然以单一成分芍药苷的HPLC含量测定来控制该制剂的质量。
该方中的赤芍主要成分为芍药苷，用色谱柱Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 ?m），改变流动相0.1%醋酸水-甲醇比例（50∶50、60∶40、70∶30），观察不同条件下供试品芍药苷的色谱图，或芍药苷与干扰峰分离度不好，或芍药苷峰形不对称。更换色谱柱Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m），进一步考察流动相不同比例（70∶30、75∶25），芍药苷峰形对称且与干扰峰分离完全，最后确定最优色谱条件：Waters SunfireTM C18（150 mm×3.9 mm，5 ?m）色谱柱，0.1%醋酸水-甲醇（75∶25）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃。该方法测定凉血胶囊中芍药苷的含量专属性及重复性好，简单快速。
考察了回流提取与超声提取，超声提取测得供试品含量为19.263 4 mg/g，回流提取测得含量为25.056 4 mg/g，结果显示，回流提取效率明显高于超声提取。考察了回流提取的时间分别为20、30、45、50、60 min，提取效率无明显差异，故选择提取时间为20 min。
参考文献：
[1] 吴楠，张秀丽.HPLC法测定利心丸中丹皮酚的含量[J].中国药事， 2009，23（6）：568-570.
[2] 李娴，王本杰，郭瑞臣，等.六味地黄丸中四种活性成分的HPLC 法测定[J].中国医药工业杂志，2010，41（2）：126-128.
（收稿日期：2012-10-26，编辑：陈静）