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结核病是严重危机全球公共卫生的问题之一。结核病的病原学检测是发现传染源的主要手段,是确定结核病的依据,在结核病的预防和治疗工作中起着不可或缺的重要作用[1]。近年来随着结核分子生物学诊断技术的快速发展,其快速、敏感、特异性高等的优点使其在临床逐渐得到应用。其中实时荧光定量聚合酶鏈反应(FQ PCR)阳性结果可作为结核病诊断的重要临床依据。本文应用Real timeFQ PCR技术与传统抗酸染色方法对比分析56例脑脊液标本,结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 检测试剂 结核分枝杆菌(TB)核酸扩增荧光检测试剂盒,由中山大学达安基因股份有限公司提供,生产批号:2009002。抗酸染色试剂为台湾BASO公司产品。
1.1.2 仪器 应用上海宏石科技有限公司的SLAN荧光定量PCR仪(注册证号:国食药监械(准)字2005第3401091号)。
1.1.3 标本来源 本院住院患者为鉴别诊断送检56例脑脊液标本,每份2 ml,各取1 ml用于检测。另20例为已确诊脑卒中患者脑脊液作为阴性对照。
1.2 方法
1.2.1 对56例临床送检标本和20例阴性对照标本均分别应用RealtimeFQPCR和抗酸染色方法按照试剂、仪器说明书严格操作。
1.2.2 统计学方法 使用统计软件SPSS 13.0对数据进行统计处理。
2 结果
2.1 56例临床送检脑脊液标本抗酸染色和Real timeFQ PCR法检测结果见表1。
表2
54例临床送检脑脊液标本抗酸染色和
Real timeFQ PCR法检测结果
抗酸染色
Real timeFQ PCR
阳性阴性合计
阳性101
阴性55055
合计65056
2.2 20例阴性对照脑脊液标本抗酸染色和Real timeFQ PCR法检测结果均为阴性。
3 讨论
实验室检测结核分枝杆菌是结核病临床诊断的重要依据。传统检测结核分枝杆菌的主要方法为涂片抗酸染色和培养法[2],但涂片抗酸染色法存在特异性差、灵敏度低的缺点,而培养法则存在需时较长的不足[3]。Real timeFQ PCR法检测结核分枝杆菌是利用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条特异性荧光探针,配以PCR缓冲液、耐热。Taq酶热聚合酶、4种脱氧核糖核酸成分在体外模拟DNA扩增。该法由较高的特异性。结核分枝杆菌易受到药物及免疫因素的影响而发生变异,用传统细菌学技术难以检出,易造成误诊或漏诊,而Real timeFQ PCR法的检测目的物是结核分枝杆菌基因保守区段,不受细胞表型和耐药性影响,可提高工作效率和检出率,其灵敏度高,检测限度可达10个菌/ml,反应体系封闭防污染,2~3 h即可获取结果。本实验组结果显示,56例临床送检脑脊液标本中抗酸染色仅1例检出阳性结果,检出率为1.78%(1/56);而Real timeFQ PCR法检测出6例阳性结果,检出率为10.7%(6/56)。经 χ2检验,P<0.01,二者之间差异有统计学意义。本组结果与文献[4]报告的阳性检出率为88.3%的结果比较相差甚远,而与文献[5]结果一致,考虑可能与病例选择以及取材的量等因素有关。但仍能提示Real timeFQ PCR法与传统的抗酸染色法比较具有敏感性高、特异性好的优点,利于临床的诊断和治疗,在对于结脑临床诊断还没有更好的其他方法应用的情况下还是具有一定的临床应用价值。
参考文献
[1] 王钊,吴明江.全国结核病防治手册.卫生部疾病控制司医政司,1999:1140.
[2] KivihyaNdugga L,van Cleef M,Juma E,et al Comparison of PCR with the routine procedure for diagnosis of the tuberculosis in a population with high prevalences of tuberculosis and human immunodeficiency virus.J Clin Microbiol,2004,42(3):10121015.
[3] 王民.应重视结核病的实验诊断.中华检验医学杂志,2005,25(8):769770.
[4] 陈建新,文芳,刘谷珩.聚合酶链反应分子灯塔法检测CSF结核分枝杆菌.卒中与神经疾病,2003,10(2):103105.
[5] 王邦松,李庆兴,卢明芹,等.荧光定量PCR诊断结核性脑膜炎的临床价值.中国微生态学杂志,2005,17(4):314.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 检测试剂 结核分枝杆菌(TB)核酸扩增荧光检测试剂盒,由中山大学达安基因股份有限公司提供,生产批号:2009002。抗酸染色试剂为台湾BASO公司产品。
1.1.2 仪器 应用上海宏石科技有限公司的SLAN荧光定量PCR仪(注册证号:国食药监械(准)字2005第3401091号)。
1.1.3 标本来源 本院住院患者为鉴别诊断送检56例脑脊液标本,每份2 ml,各取1 ml用于检测。另20例为已确诊脑卒中患者脑脊液作为阴性对照。
1.2 方法
1.2.1 对56例临床送检标本和20例阴性对照标本均分别应用RealtimeFQPCR和抗酸染色方法按照试剂、仪器说明书严格操作。
1.2.2 统计学方法 使用统计软件SPSS 13.0对数据进行统计处理。
2 结果
2.1 56例临床送检脑脊液标本抗酸染色和Real timeFQ PCR法检测结果见表1。
表2
54例临床送检脑脊液标本抗酸染色和
Real timeFQ PCR法检测结果
抗酸染色
Real timeFQ PCR
阳性阴性合计
阳性101
阴性55055
合计65056
2.2 20例阴性对照脑脊液标本抗酸染色和Real timeFQ PCR法检测结果均为阴性。
3 讨论
实验室检测结核分枝杆菌是结核病临床诊断的重要依据。传统检测结核分枝杆菌的主要方法为涂片抗酸染色和培养法[2],但涂片抗酸染色法存在特异性差、灵敏度低的缺点,而培养法则存在需时较长的不足[3]。Real timeFQ PCR法检测结核分枝杆菌是利用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条特异性荧光探针,配以PCR缓冲液、耐热。Taq酶热聚合酶、4种脱氧核糖核酸成分在体外模拟DNA扩增。该法由较高的特异性。结核分枝杆菌易受到药物及免疫因素的影响而发生变异,用传统细菌学技术难以检出,易造成误诊或漏诊,而Real timeFQ PCR法的检测目的物是结核分枝杆菌基因保守区段,不受细胞表型和耐药性影响,可提高工作效率和检出率,其灵敏度高,检测限度可达10个菌/ml,反应体系封闭防污染,2~3 h即可获取结果。本实验组结果显示,56例临床送检脑脊液标本中抗酸染色仅1例检出阳性结果,检出率为1.78%(1/56);而Real timeFQ PCR法检测出6例阳性结果,检出率为10.7%(6/56)。经 χ2检验,P<0.01,二者之间差异有统计学意义。本组结果与文献[4]报告的阳性检出率为88.3%的结果比较相差甚远,而与文献[5]结果一致,考虑可能与病例选择以及取材的量等因素有关。但仍能提示Real timeFQ PCR法与传统的抗酸染色法比较具有敏感性高、特异性好的优点,利于临床的诊断和治疗,在对于结脑临床诊断还没有更好的其他方法应用的情况下还是具有一定的临床应用价值。
参考文献
[1] 王钊,吴明江.全国结核病防治手册.卫生部疾病控制司医政司,1999:1140.
[2] KivihyaNdugga L,van Cleef M,Juma E,et al Comparison of PCR with the routine procedure for diagnosis of the tuberculosis in a population with high prevalences of tuberculosis and human immunodeficiency virus.J Clin Microbiol,2004,42(3):10121015.
[3] 王民.应重视结核病的实验诊断.中华检验医学杂志,2005,25(8):769770.
[4] 陈建新,文芳,刘谷珩.聚合酶链反应分子灯塔法检测CSF结核分枝杆菌.卒中与神经疾病,2003,10(2):103105.
[5] 王邦松,李庆兴,卢明芹,等.荧光定量PCR诊断结核性脑膜炎的临床价值.中国微生态学杂志,2005,17(4):314.