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摘要：当归是一味较为常见的中药药材，具有活血补血、调经止痛、润燥滑肠等多种功效。目前在我国的各大药店都有当归出售。然而在经过有关部门调查后发现，市场中销售流通的当归在一定程度上存在着质量问题，其成分以及功效都大打折扣，这对于消费者的健康来讲是非常不利的。为了进一步规范药材市场，加强当归的质量管理。我们提出了利用高效液相色谱对当归的指纹图谱进行检测，以确定当归药材的质量能否符合相关要求。现本文就针对高效液相色谱对当归指纹图谱检测试验进行研究分析。
关键词：高效液相色谱 当归 指纹图谱 实验
当归，又名干归、云归，是一种多年生草本植物，在植物的分类中隶属于伞形科植物。在中药的药材中所指的当归一般是指该植物的干燥根部。当归在中药中属于一种味甘、辛、苦的药材，性温和，主要对心、肝、脾经具有很好的调节作用。在中药医学的临床研究中具有很广泛的应用范围。当归在我国的多个地区都有种植生长，不同地区的气候与自然条件不同，所生长出的当归的药效是有很大差别的。为了能够更精确的掌握当归的药效，需要对其主要成分进行分析检测，以最大程度的保证临床治疗效果。因为，必须要有一种简便可行的有效方法来对当归进行检测。本文中所研究的是采用高效液相色谱法进行指纹图谱研究，具体操作方法是以当归的主要成分，阿魏酸为研究对象，并对17个地区的当归药材进行实验检测，以确定该方法是否可行。
1、实验概述
本实验的目的是为了建立当归药材的HPLC 指纹图谱， 为当归药材的规范化种植及质量标准的建立提供试验依据。最终实验结果显示：在选定的色谱条件下， 得到当归药材指纹图谱， 标定出6 个共有峰， 并与不同色谱条件下得到的指纹图谱进行比较。同时对含当归药材的中成药建立指纹图谱， 检出当归药材的共有峰。得出结论为： 用该方法建立当归药材指纹图谱， 对当归药材进行质量控制是可行的。
2、实验所用的仪器与材料准备
超声波清洗机（33KHz？250W ） （上海必能信有限公司） ； LC26A 高效液相色谱仪（日本岛津公司） ； 中北色谱工作站（大连化物所） ； SPD26AV 可见——紫外检测器。乙腈、甲醇为色谱纯（天津四友生物医学技术有限公司） ； 磷酸、三乙胺为分析纯（沈阳化学试剂厂）。
阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。样品为海拉尔、沈阳、哈尔滨、丹东、天津、山东、云南、新疆、陕西、广西、湖南、甘肃、广州、黑龙江、辽阳、北京、上海17 个不同地区的市售当归药材。
3、具体的实验方法
在实际的实验过程中，由于高效液相色谱法是一种通过对比分析而得出实验结果的实验方法，为此在实验之前，首先应确定色谱的条件。本实验中确定了色谱的条件，色谱柱为Sh im -pack CLC-DOS柱（6. 0 mm ×150mm ， 5 um） ； 流动相为甲醇-乙腈-磷酸三乙胺水溶液（3∶12∶85） ； 检测波长313 nm； 柱温40℃； 流速1. 0 m l/m in。
在确定了试验所需的色谱条件之后，就需要对对照品的溶液进行配制，为后期的实验对照做好基础工作。在制备对照品溶液时首先要用精密仪器称取一定量的干燥恒重的阿魏酸对照品，并加入甲醇将其配制成每ml含0. 008 58mg 阿魏酸的溶液。
对照溶液配制完成后，就要开始配制试验品溶液。本实验中一共选取了17个不同地区的不同当归药材作为试验品。首先我们将当归做粉碎处理，并将这些粉状当归进行筛选，滤去较大的块状，再以精密仪器称取筛过的粉末3g，将这些粉状物体放入有塞子的锥形瓶里，加甲醇20m l， 超声处理15m in， 放冷， 滤过， 滤液定容在25m l 量瓶中， 溶液经微孔滤膜（0. 45 Lm） 滤过， 滤液作为供试品溶液。
本实验选用的测定方法：分别精密吸取对照品溶液与17 个地区的供试品溶液各5 ul， 注入高效液相色谱仪， 测定， 得到不同地区当归药材的HPLC 色谱图。
另外，为确定该方法的可靠性， 本试验取甘肃地区的当归药材， 以阿魏酸为对照品， 对条件稳定性、仪器精密度和实验方法的重现性作了考察。
稳定性实验取同一份供试品溶液， 分别在0， 2， 4， 6， 8，16 h 进行分析， 考察各色谱峰相对保留时间， RSD 为0. 04%～0. 78% ， 结果表明实验条件在16 h 内稳定。
精密度实验取同一份供试品溶液， 在同一色谱条件下，连续进样5 次， 考察各主要色谱峰的相对保留时间， RSD 为0. 04%～ 0. 19% ， 结果表明仪器精密度良好。
重复性实验取甘肃地区当归药材5 g， 共5 份， 按上述供试品溶液制备及测定方法进行操作， 考察各主要色谱峰的相对保留时间， 结果R SD 为0. 06%～ 0. 35% ， 表明方法重复性良好。
4、结果与结论
当归药材指纹图谱的建立由于保留时间受到各种实验因素的影响， 每次实验的数据会出现不一致的现象， 故对各个色谱峰的峰位， 采用相对保留时间来确定， 以消除系统误差。
本实验以阿魏酸色谱峰为参照， 确定其相对保留时间1，计算其它主要色谱峰的相对保留时间， 标定出6 个共有峰， 分别为： 0. 283 1 （ ± 0. 48%） ， 0. 414 4 （ ± 1. 95%） ， 0. 494 6 （ ±1. 44% ） ， 0. 688 4 （±2. 22%） ， 1. 000， 1. 164 0（±3. 92%）。计算结果显示各组共有峰R SD < 5% ， 表明利用该方法对当归药材进行质量控制具有可行性。
目前指纹图谱技术在中药质量控制中处于起步阶段， 包括色谱条件尚需进行规范化。考虑方法的普适性， 本试验随机选取17 个地区中10 个地区的当归药材， 在其它条件不变的情况下， 采用色谱柱为Diamonsil C18 （200 mm ×4. 6 mm ， 5 Lm ） 柱对其进行指纹图谱分析， 以阿魏酸色谱峰为参照， 标定出6 个共有峰， 分别为0. 266 1 （±4. 78%） ， 0. 324 1 （±0. 08%） ， 0. 421 3 （±0. 86% ） ， 0. 636 0 （±0. 10%） ， 1. 000， 1. 078 0（±0. 05%）。实验结果提示， 不同色谱条件下得到的色谱峰有一定的差别， 考虑在建立指纹图谱体系时， 是否要固定色谱条件。
5、展望
利用高效液相色谱法对当归的指纹图谱进行检测鉴定的目的主要是为了给当归药材的质量鉴定提供一种行之有效的方法，是为了提高当归的临床医药效果而服务的。同样的，这种方法同样也可以应用在其他的中药药材检验中。为了验证这一方法的可行性。科研人员利用该实验方法对含有当归的中成药进行检验，实验结果表明当归的指纹峰有6个，根据指纹图谱的标准进行对照分析，可以发现其检测结果是相当精准的。
并且，本实验中所采用的当归是由17个不同地区种植生长的当归所得根块，这就说明在不同产地、不同采集时间下的当归样品，其利用高效液相色谱进行指纹图谱验证都是具有很高的相似度的。这也体现出了本文中所研究的当归的指纹图谱是有着较高的稳定性与重复性的，其所得出的当归的指纹图谱也可以作为一定的参考对照图谱。
6、结语
总之，在我国的中药药材中，具有非常丰富的草药资源，且经过长期的医学流传，诸多有效的中药药方以及中医药理论都为中药学的发展提供了基础。在未来的中医发展中，找出安全有效且稳定可靠的中药药材是确保中医临床疗效的关键。为此，我们应加大对中药质量控制的力度，提高中药检验水平，采用高效液相色谱法对中药的指纹图谱进行研究分析是一种有效的中药质量检验方法，这也是国际公认的一种检测方法。本文以当归为例，论证了其可行性与高效性。由此可见，建立可操作的、规范化的中药指纹图谱体系是中药质量控制的大势所趋。
关键词：高效液相色谱 当归 指纹图谱 实验
当归，又名干归、云归，是一种多年生草本植物，在植物的分类中隶属于伞形科植物。在中药的药材中所指的当归一般是指该植物的干燥根部。当归在中药中属于一种味甘、辛、苦的药材，性温和，主要对心、肝、脾经具有很好的调节作用。在中药医学的临床研究中具有很广泛的应用范围。当归在我国的多个地区都有种植生长，不同地区的气候与自然条件不同，所生长出的当归的药效是有很大差别的。为了能够更精确的掌握当归的药效，需要对其主要成分进行分析检测，以最大程度的保证临床治疗效果。因为，必须要有一种简便可行的有效方法来对当归进行检测。本文中所研究的是采用高效液相色谱法进行指纹图谱研究，具体操作方法是以当归的主要成分，阿魏酸为研究对象，并对17个地区的当归药材进行实验检测，以确定该方法是否可行。
1、实验概述
本实验的目的是为了建立当归药材的HPLC 指纹图谱， 为当归药材的规范化种植及质量标准的建立提供试验依据。最终实验结果显示：在选定的色谱条件下， 得到当归药材指纹图谱， 标定出6 个共有峰， 并与不同色谱条件下得到的指纹图谱进行比较。同时对含当归药材的中成药建立指纹图谱， 检出当归药材的共有峰。得出结论为： 用该方法建立当归药材指纹图谱， 对当归药材进行质量控制是可行的。
2、实验所用的仪器与材料准备
超声波清洗机（33KHz？250W ） （上海必能信有限公司） ； LC26A 高效液相色谱仪（日本岛津公司） ； 中北色谱工作站（大连化物所） ； SPD26AV 可见——紫外检测器。乙腈、甲醇为色谱纯（天津四友生物医学技术有限公司） ； 磷酸、三乙胺为分析纯（沈阳化学试剂厂）。
阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。样品为海拉尔、沈阳、哈尔滨、丹东、天津、山东、云南、新疆、陕西、广西、湖南、甘肃、广州、黑龙江、辽阳、北京、上海17 个不同地区的市售当归药材。
3、具体的实验方法
在实际的实验过程中，由于高效液相色谱法是一种通过对比分析而得出实验结果的实验方法，为此在实验之前，首先应确定色谱的条件。本实验中确定了色谱的条件，色谱柱为Sh im -pack CLC-DOS柱（6. 0 mm ×150mm ， 5 um） ； 流动相为甲醇-乙腈-磷酸三乙胺水溶液（3∶12∶85） ； 检测波长313 nm； 柱温40℃； 流速1. 0 m l/m in。
在确定了试验所需的色谱条件之后，就需要对对照品的溶液进行配制，为后期的实验对照做好基础工作。在制备对照品溶液时首先要用精密仪器称取一定量的干燥恒重的阿魏酸对照品，并加入甲醇将其配制成每ml含0. 008 58mg 阿魏酸的溶液。
对照溶液配制完成后，就要开始配制试验品溶液。本实验中一共选取了17个不同地区的不同当归药材作为试验品。首先我们将当归做粉碎处理，并将这些粉状当归进行筛选，滤去较大的块状，再以精密仪器称取筛过的粉末3g，将这些粉状物体放入有塞子的锥形瓶里，加甲醇20m l， 超声处理15m in， 放冷， 滤过， 滤液定容在25m l 量瓶中， 溶液经微孔滤膜（0. 45 Lm） 滤过， 滤液作为供试品溶液。
本实验选用的测定方法：分别精密吸取对照品溶液与17 个地区的供试品溶液各5 ul， 注入高效液相色谱仪， 测定， 得到不同地区当归药材的HPLC 色谱图。
另外，为确定该方法的可靠性， 本试验取甘肃地区的当归药材， 以阿魏酸为对照品， 对条件稳定性、仪器精密度和实验方法的重现性作了考察。
稳定性实验取同一份供试品溶液， 分别在0， 2， 4， 6， 8，16 h 进行分析， 考察各色谱峰相对保留时间， RSD 为0. 04%～0. 78% ， 结果表明实验条件在16 h 内稳定。
精密度实验取同一份供试品溶液， 在同一色谱条件下，连续进样5 次， 考察各主要色谱峰的相对保留时间， RSD 为0. 04%～ 0. 19% ， 结果表明仪器精密度良好。
重复性实验取甘肃地区当归药材5 g， 共5 份， 按上述供试品溶液制备及测定方法进行操作， 考察各主要色谱峰的相对保留时间， 结果R SD 为0. 06%～ 0. 35% ， 表明方法重复性良好。
4、结果与结论
当归药材指纹图谱的建立由于保留时间受到各种实验因素的影响， 每次实验的数据会出现不一致的现象， 故对各个色谱峰的峰位， 采用相对保留时间来确定， 以消除系统误差。
本实验以阿魏酸色谱峰为参照， 确定其相对保留时间1，计算其它主要色谱峰的相对保留时间， 标定出6 个共有峰， 分别为： 0. 283 1 （ ± 0. 48%） ， 0. 414 4 （ ± 1. 95%） ， 0. 494 6 （ ±1. 44% ） ， 0. 688 4 （±2. 22%） ， 1. 000， 1. 164 0（±3. 92%）。计算结果显示各组共有峰R SD < 5% ， 表明利用该方法对当归药材进行质量控制具有可行性。
目前指纹图谱技术在中药质量控制中处于起步阶段， 包括色谱条件尚需进行规范化。考虑方法的普适性， 本试验随机选取17 个地区中10 个地区的当归药材， 在其它条件不变的情况下， 采用色谱柱为Diamonsil C18 （200 mm ×4. 6 mm ， 5 Lm ） 柱对其进行指纹图谱分析， 以阿魏酸色谱峰为参照， 标定出6 个共有峰， 分别为0. 266 1 （±4. 78%） ， 0. 324 1 （±0. 08%） ， 0. 421 3 （±0. 86% ） ， 0. 636 0 （±0. 10%） ， 1. 000， 1. 078 0（±0. 05%）。实验结果提示， 不同色谱条件下得到的色谱峰有一定的差别， 考虑在建立指纹图谱体系时， 是否要固定色谱条件。
5、展望
利用高效液相色谱法对当归的指纹图谱进行检测鉴定的目的主要是为了给当归药材的质量鉴定提供一种行之有效的方法，是为了提高当归的临床医药效果而服务的。同样的，这种方法同样也可以应用在其他的中药药材检验中。为了验证这一方法的可行性。科研人员利用该实验方法对含有当归的中成药进行检验，实验结果表明当归的指纹峰有6个，根据指纹图谱的标准进行对照分析，可以发现其检测结果是相当精准的。
并且，本实验中所采用的当归是由17个不同地区种植生长的当归所得根块，这就说明在不同产地、不同采集时间下的当归样品，其利用高效液相色谱进行指纹图谱验证都是具有很高的相似度的。这也体现出了本文中所研究的当归的指纹图谱是有着较高的稳定性与重复性的，其所得出的当归的指纹图谱也可以作为一定的参考对照图谱。
6、结语
总之，在我国的中药药材中，具有非常丰富的草药资源，且经过长期的医学流传，诸多有效的中药药方以及中医药理论都为中药学的发展提供了基础。在未来的中医发展中，找出安全有效且稳定可靠的中药药材是确保中医临床疗效的关键。为此，我们应加大对中药质量控制的力度，提高中药检验水平，采用高效液相色谱法对中药的指纹图谱进行研究分析是一种有效的中药质量检验方法，这也是国际公认的一种检测方法。本文以当归为例，论证了其可行性与高效性。由此可见，建立可操作的、规范化的中药指纹图谱体系是中药质量控制的大势所趋。