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摘要：纤维素是自然界中分布最广泛的一种生物质能源，筛选能够高效降解纤维素的菌株对于开发利用这类物质具有重要意义。从土壤中分离纯化获得一株高产纤维素酶的菌株TW063-3，通过形态学结合分子生物学鉴定得出，该菌株为草酸青霉。通过单因素优化试验寻找最佳培养条件，然后通过正交试验确定关键因子的最佳参数。筛选得出最佳培养条件：15 g/L羧甲基纤维素钠 2 g/L硝酸铵，pH值为3.0，200 r/min培养6 d。在最佳培养条件下，酶活性比优化前提高了34.1%，达到524.4 U/mL。研究结果可为生物降解纤维素酶提供一定的理论及应用价值。
关键词：纤维素酶;草酸青霉;培养基优化
纤维素酶能够将自然界中最丰富的生物质能源——纤维素类物质分解成可溶性单糖，从而为大批量生产生物燃料乙醇提供廉价原料[1]。经过50多年的研究发现，纤维素酶已经成为第四大工业酶种[2]，在生物能开发、食品、畜牧业及工农业废弃物回收等多个领域都具有远大的应用前景[3]。
已有研究发现，自然界中能分解纤维素的生物类群主要是细菌与真菌[4]。丝状真菌是产纤维素酶非常重要的一大类群，能够产生多种胞外纤维素酶[5]。里氏木霉是研究得较为清楚的产纤维素酶菌株，但是其生长量相对较小，产酶量不能满足工业中转化纤维素的需求[6]。许多研究发现，青霉菌具有胞内分泌组分齐全、纤维素酶活性高、易培养和生长速度快的优势[7]，而且青霉源纤维素酶能产生比木霉源纤维素酶较多的β-葡萄糖苷酶[8]。
本研究从海滩边土壤筛选获得一株高产纤维素酶的青霉菌株，通过优化培养条件，旨在提高该菌株的纤维素酶产量，研究成果可为今后工业化应用纤维素酶提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 刚果红筛选培养基 培养基配方为10 g/L羧甲基纤维素钠，0.2 g/L刚果红，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，14 g/L琼脂。
1.1.2 摇瓶发酵培养基 培养基配方为10 g/L羧甲基纤维素钠，3 g/L蛋白胨，0.5 g/L酵母粉，4 g/L （NH4）2SO4，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.3 g/L CaCl2，0.5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L吐温-80。
1.2 方法
1.2.1 样品采集与处理 土壤样品从海洋和森林中采集，取5点采样，混合为1个样品。在样品中加入适量纯净水后，加玻璃珠打散，取上层液体，稀释后涂板筛选。
1.2.2 纤维素酶活性的测定 采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定纤维素酶活性。对照（CK）处理方法：取1 mL菌液，煮沸（100 ℃、5 min）灭活后用冷水冷却5 min，之后加入1 mL 1%羧甲基纤维素钠溶液和3 mL DNS，混合均匀后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷却5 min，然后在波长（λ）为540 nm的紫外-可见分光光度计中测吸光度。
酶活性的测定：取1 mL菌液，加入1 mL 1%羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀后在37 ℃水浴锅中水浴30 min，煮沸（100 ℃、5 min）灭活后用冷水冷却 5 min，再加入3 mL DNS溶液，混合均匀后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷却5 min。每组测定吸光度前用其对应的CK清零后再测定540 nm处的吸光度，每瓶设3次重复。酶活性单位的定义：催化产生1 μg葡萄糖的酶量为1 U[9]。
酶活性（U/mL）=D540 nm×n×1 000/K。
式中：n为稀释倍数;K为标准曲线斜率。
1.2.3 高产纤维素酶菌株的筛选 将菌株活化后接种至刚果红初筛平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养。待初筛获得的高产漆酶菌株活化产孢后，用3层擦镜纸过滤获得孢子，稀释至1×104 个/mL，在每瓶培养基（250 mL三角瓶装量50 mL）中接入1 mL孢子悬液，28 ℃、200 r/min培养5 d后测定酶活性。
1.2.4 发酵产酶条件的优化
1.2.4.1 碳源的优化 对经摇瓶复筛得到的最佳菌株进行培养基的优化，其中发酵培养基的碳源分别取10 g/L羧甲基纤维素钠、10%葡萄糖、10%淀粉、10%蔗糖进行筛选，其余条件不变，发酵5 d后测定酶活性，确定最佳碳源。
1.2.4.2 氮源的优化 将发酵培养基的碳源改为最适碳源，分别取2 g/L硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、蛋白胨进行初始发酵培养基最适氮源的筛选，其余条件不变，发酵5 d后，测定酶活性，确定最佳氮源。
1.2.4.3 pH值的优化 取最适碳源和氮源，pH值分别设为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其余条件不变，发酵5 d后，测定酶活性，确定最佳pH值。
1.2.4.4 发酵培养时间的优化 选择优化后的最佳培养基进行发酵培养，从培养2 d开始，每天测定1次纖维素酶活性，确定最佳培养时间。
1.2.4.5 正交优化 依据单因素试验结果，选择碳源、氮源、pH值和生长时间，设计4因素4水平正交试验[10]，采用 L16（44）正交表。
1.2.5 菌种的鉴定
1.2.5.1 形态学的鉴定 将菌种TW063-3活化后，接1小块菌饼到CYA平板上，于28 ℃培养3 d产孢后，挑取少量带孢子的菌丝置于载玻片上，显微观察并拍照。
1.2.5.2 分子生物学鉴定 DNA提取参照生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）DneasyPlant Mini Kit（50）的试剂盒。采用真菌18S rDNA通用引物ITS1f（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增ITS（内转录间隔区）序列，PCR扩增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33个循环;72 ℃10 min。经生工生物工程（上海）股份有限公司测序后通过MEGA 7构建系统进化树。 2 结果与分析
2.1 高产纤维素酶菌株的筛选
本研究共分离纯化164株菌株，通过初筛获得6株纤维素酶活性最高的菌株（图1）。复筛结果表明，菌株TW063-3（P=8.73e-10
关键词：纤维素酶;草酸青霉;培养基优化
纤维素酶能够将自然界中最丰富的生物质能源——纤维素类物质分解成可溶性单糖，从而为大批量生产生物燃料乙醇提供廉价原料[1]。经过50多年的研究发现，纤维素酶已经成为第四大工业酶种[2]，在生物能开发、食品、畜牧业及工农业废弃物回收等多个领域都具有远大的应用前景[3]。
已有研究发现，自然界中能分解纤维素的生物类群主要是细菌与真菌[4]。丝状真菌是产纤维素酶非常重要的一大类群，能够产生多种胞外纤维素酶[5]。里氏木霉是研究得较为清楚的产纤维素酶菌株，但是其生长量相对较小，产酶量不能满足工业中转化纤维素的需求[6]。许多研究发现，青霉菌具有胞内分泌组分齐全、纤维素酶活性高、易培养和生长速度快的优势[7]，而且青霉源纤维素酶能产生比木霉源纤维素酶较多的β-葡萄糖苷酶[8]。
本研究从海滩边土壤筛选获得一株高产纤维素酶的青霉菌株，通过优化培养条件，旨在提高该菌株的纤维素酶产量，研究成果可为今后工业化应用纤维素酶提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 刚果红筛选培养基 培养基配方为10 g/L羧甲基纤维素钠，0.2 g/L刚果红，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，14 g/L琼脂。
1.1.2 摇瓶发酵培养基 培养基配方为10 g/L羧甲基纤维素钠，3 g/L蛋白胨，0.5 g/L酵母粉，4 g/L （NH4）2SO4，2 g/L K2HPO4·3H2O，0.3 g/L CaCl2，0.5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L吐温-80。
1.2 方法
1.2.1 样品采集与处理 土壤样品从海洋和森林中采集，取5点采样，混合为1个样品。在样品中加入适量纯净水后，加玻璃珠打散，取上层液体，稀释后涂板筛选。
1.2.2 纤维素酶活性的测定 采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定纤维素酶活性。对照（CK）处理方法：取1 mL菌液，煮沸（100 ℃、5 min）灭活后用冷水冷却5 min，之后加入1 mL 1%羧甲基纤维素钠溶液和3 mL DNS，混合均匀后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷却5 min，然后在波长（λ）为540 nm的紫外-可见分光光度计中测吸光度。
酶活性的测定：取1 mL菌液，加入1 mL 1%羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀后在37 ℃水浴锅中水浴30 min，煮沸（100 ℃、5 min）灭活后用冷水冷却 5 min，再加入3 mL DNS溶液，混合均匀后沸水（100 ℃、5 min）水浴，再用冷水冷却5 min。每组测定吸光度前用其对应的CK清零后再测定540 nm处的吸光度，每瓶设3次重复。酶活性单位的定义：催化产生1 μg葡萄糖的酶量为1 U[9]。
酶活性（U/mL）=D540 nm×n×1 000/K。
式中：n为稀释倍数;K为标准曲线斜率。
1.2.3 高产纤维素酶菌株的筛选 将菌株活化后接种至刚果红初筛平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养。待初筛获得的高产漆酶菌株活化产孢后，用3层擦镜纸过滤获得孢子，稀释至1×104 个/mL，在每瓶培养基（250 mL三角瓶装量50 mL）中接入1 mL孢子悬液，28 ℃、200 r/min培养5 d后测定酶活性。
1.2.4 发酵产酶条件的优化
1.2.4.1 碳源的优化 对经摇瓶复筛得到的最佳菌株进行培养基的优化，其中发酵培养基的碳源分别取10 g/L羧甲基纤维素钠、10%葡萄糖、10%淀粉、10%蔗糖进行筛选，其余条件不变，发酵5 d后测定酶活性，确定最佳碳源。
1.2.4.2 氮源的优化 将发酵培养基的碳源改为最适碳源，分别取2 g/L硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、蛋白胨进行初始发酵培养基最适氮源的筛选，其余条件不变，发酵5 d后，测定酶活性，确定最佳氮源。
1.2.4.3 pH值的优化 取最适碳源和氮源，pH值分别设为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其余条件不变，发酵5 d后，测定酶活性，确定最佳pH值。
1.2.4.4 发酵培养时间的优化 选择优化后的最佳培养基进行发酵培养，从培养2 d开始，每天测定1次纖维素酶活性，确定最佳培养时间。
1.2.4.5 正交优化 依据单因素试验结果，选择碳源、氮源、pH值和生长时间，设计4因素4水平正交试验[10]，采用 L16（44）正交表。
1.2.5 菌种的鉴定
1.2.5.1 形态学的鉴定 将菌种TW063-3活化后，接1小块菌饼到CYA平板上，于28 ℃培养3 d产孢后，挑取少量带孢子的菌丝置于载玻片上，显微观察并拍照。
1.2.5.2 分子生物学鉴定 DNA提取参照生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech）DneasyPlant Mini Kit（50）的试剂盒。采用真菌18S rDNA通用引物ITS1f（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增ITS（内转录间隔区）序列，PCR扩增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33个循环;72 ℃10 min。经生工生物工程（上海）股份有限公司测序后通过MEGA 7构建系统进化树。 2 结果与分析
2.1 高产纤维素酶菌株的筛选
本研究共分离纯化164株菌株，通过初筛获得6株纤维素酶活性最高的菌株（图1）。复筛结果表明，菌株TW063-3（P=8.73e-10