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摘要：蔗糖转运蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）是蔗糖装载、卸载、分配的重要载体，ZmSUT4是玉米低亲和、高转运能力SUT4亚族的唯一成员。以黄早四ZmSUT4全长cDNA序列为模板，设计带有限制性内切酶位点的特异性引物，PCR扩增获得正向、反向2个片段，将反向、正向片段双酶切后依次插入pGreen-HY104植物表达载体中，从而构建由35S启动子调控的ZmSUT4基因RNA干扰（RNAi）的植物表达载体HY104-A-S，然后通过冻融法将载体质粒转入含有pSoup质粒的农杆菌EHA105中。ZmSUT4基因RNAi的植物表达载体的构建为研究ZmSUT4基因的功能奠定了基础。
关键词：玉米；ZmSUT4基因；RNAi植物表达；载体构建
中图分类号：S513.03；Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0042-03
玉米的籽粒产量主要取决于籽粒形成过程中成熟叶片（源）光合产物的生产、韧皮部的运输（流）以及在籽粒（库）中的积累。光合产物的分配运输是植物体内源、流、库相互协调的结果，源足、库大、流畅是高产的基础[1-2]。目前对源、库的特性研究较多，但是由于受研究方法和条件等限制，如对DNA序列了解的限制，对流的了解还相当不足。研究发现，随着种植密度增加，收获指数快速下降，表明在较高密度条件下，流对产量的限制作用在增加[3]。流包括韧皮部的装载、筛管中运输、韧皮部卸出和同化物的重新吸收。蔗糖作为高等植物光合同化物运输的主要形式，也是联系源库之间主要的糖类[4]。细胞膜上的蔗糖转运蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）承担着蔗糖从源细胞的外运、韧皮部的装载和卸载，以及向库細胞的装入功能，从而影响蔗糖的运输方向、速率和分配，其基因表达受多种环境因子的调控。ZmSUT4是玉米体内唯一的高蔗糖转运能力SUT4亚族成员，在植物体内的蔗糖运输和分配过程中发挥着不可替代的重要作用。但是，关于玉米SUT4的研究才刚刚起步，李志鹏仅利用逆转录PCR（RT-PCR）技术检测ZmSUT4在玉米籽粒灌浆期花柄、籽粒等库器官的表达情况，未构建RNA干扰载体，分析ZmSUT4表达被抑制对植株生长发育及相关基因表达的影响[5]。本研究利用ZmSUT4基因的全长cDNA序列，构建ZmSUT4基因RNA干扰载体，为进一步研究ZmSUT4基因的生理效应及作用机制奠定基础，也为研究其他SUTs基因的功能提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
所用玉米材料为玉米优良自交系黄早四。
KAPA Hifi高保真DNA聚合酶，购自美国KAPA Biosystems公司；T4-DNA连接酶、限制性内切酶，购自NEB公司；植物总RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit（cDNA第1链合成试剂盒）、质粒小提试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京TIANGEN公司；pEASY-T、大肠杆菌DH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA marker DL2000，购自TaKaRa公司。引物合成和测序由上海立菲生物技术有限公司完成。Taq酶、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。植物表达载体pGreen-HY104质粒及含有pSoup质粒的农杆菌EHA105，均由国家玉米改良中心徐明良实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 玉米ZmSUT4基因cDNA序列的获得 利用植物总RNA提取试剂盒提取黄早四幼苗总RNA，利用反转录试剂盒获得黄早四全长cDNA序列。
1.2.2 干扰片段的选择及引物设计 根据NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上已发表的玉米ZmSUT4基因的全长cDNA序列，选择该序列上的特异片段及表达载体pGreen-HY104的限制性内切酶酶切位点，并设计引物。分别在5′端加上PstⅠ-EcoRⅠ、BamHⅠ-XhoⅠ酶切位点，引物序列为：F：5′-GCTGCAGAATTCGTCTGGAAACTCTTTGTGGGT-3′；R：5′-CGGATCCTCGAGCTCCTGTAACTTTTATTCATTGCT-3′。预期扩增片段长度为219 bp。
1.2.3 干扰片段的扩增 以全长cDNA序列为模板进行PCR扩增。反应条件为：热启动；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，无非特异性条带，则直接进行后续试验。
1.2.4 RNA干扰（RNAi）植物表达载体的构建 将PCR产物连接到T载体，获得T-ZmSUT4，将T-ZmSUT4转化大肠杆菌DH5α，于37 ℃暗培养12～16 h，进行蓝白斑筛选；挑取白色单菌落，进行PCR检测，将含有目标克隆的单菌落于 37 ℃ 摇菌过夜，送公司测序。提取包含正确序列T载体的质粒，用XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切表达载体pGreen-HY104、T-ZmSUT4质粒，回收酶切产物；用T4-DNA连接酶过夜连接，将干扰片段反向插入表达载体中，得到HY104-A，用其转化大肠杆菌，Kan抗性筛选目标克隆，提取质粒验证；用BamHⅠ、PstⅠ酶切载体HY104-A、T-ZmSUT4，回收酶切产物，过夜连接得到HY104-A-S（图1），转化大肠杆菌，Kan抗性筛选目标克隆，提取质粒，用EcoRⅠ进行验证。
1.2.5 RNAi植物表达载体转化农杆菌EHA105 采用冻融
法[6]将构建好的RNAi植物表达载体HY104-A-S转化含有pSoup质粒的农杆菌EHA105感受态细胞，涂于含有Rif（50 μg/mL）、Kan（100 μg/mL）的LB固体培养基上，28 ℃暗培养2 d。挑取阳性菌落，进行菌落PCR鉴定。 2 結果与分析
2.1 干扰片段的PCR扩增
以玉米ZmSUT4基因的cDNA序列为模板，利用携带酶切位点的特异引物进行PCR扩增，电泳检测扩增产物。由图2可知，本试验得到219 bp的片段。将该片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，菌落经PCR鉴定后，将阳性克隆送公司测序，测序结果与黄早四cDNA序列完全一致（图3）。
2.2 RNAi表达载体的构建
提取T-ZmSUT4、pGreen-HY104载体的质粒，用 XhoⅠ、EcoRⅠ对2种质粒进行双酶切，结果见图4，胶回收连接后转化到大肠杆菌DH5α中，Kan抗性筛选目标克隆，对菌落进行PCR鉴定。提取正确克隆的质粒HY104-A，利用BamHⅠ、PstⅠ酶切载体HY104-A、T-ZmSUT4，结果见图5。回收酶切产物，连接后得到HY104-A-S，转化大肠杆菌，Kan抗性筛选目标克隆，提取质粒验证，利用EcoRⅠ酶切该质粒，预测应得到约1 000 bp的小片段。图6电泳结果与预期一致，表明植物表达载体HY104-A-S构建正确。
2.3 表达载体转化根瘤农杆菌
分别以阳性对照质粒HY104-A-S和含有表达载体的农杆菌菌落为模板，利用特异性引物进行PCR扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定表明：含有表达载体的农杆菌菌液所得条带正确（图7），表明HY104-A-S载体质粒已转入含pSoup质粒农杆菌EHA105中。
3 讨论
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源或外源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）高效特异性降解与
其高度同源的mRNA，有效地阻断目的基因的表达，从而获得功能缺失的突变体，因此该技术可作为研究基因组功能、创造分子育种新材料的有效手段。目前，RNA干扰技术已在玉米、水稻、大麦、小麦、大豆和马铃薯等作物中成功应用[7-13]。Wesley等研究发现，双链RNA的长度影响目的基因的沉默效率，干扰片段长度在98～853 bp之间时基因沉默效率较高[14-15]。此外，在插入的正向与反向干扰片段之间应有适当长度的间隔序列，以便RNAi表达载体在转入玉米后形成含有发夹结构的dsRNA，进而干扰ZmSUT4基因的表达。
Chincinska等利用RNA干扰技术研究发现，与野生型植株相比，马铃薯StSUT4-RNAi植株源叶中蔗糖输出增加，促使蔗糖、淀粉在块茎等库器官大量积累，进而引起块茎产量增加[16-17]。本研究成功构建了玉米ZmSUT4基因的RNAi植物表达载体，不但为探究ZmSUT4基因表达在源库互作中的功能奠定了基础，还为进一步研究蔗糖运输、分配的调节机制提供理论依据，也为利用转基因技术调节蔗糖的运输、分配，从而提高玉米籽粒产量提供参考。
参考文献：
[1]王文静. 不同穗型冬小麦籽粒灌浆期源库强度及其与淀粉积累的关系[J]. 作物学报，2004，30（9）：916-921.
[2]王玲玲，杜吉到，郑殿峰，等. 大豆源库流关系的研究进展[J]. 大豆科学，2009，28（1）：167-171.
[3]关义新，凌碧莹，林 葆，等. 高产春玉米群体库及源库流的综合调控[J]. 沈阳农业大学学报，2000，31（6）：537-540.
[4]Saint Pierre C，Peterson C J，Ross A S，et al. Winter wheat genotypes under different levels of nitrogen and water stress：changes in grain protein 40 composition[J]. Journal of Cereal Science，2008，47（3）：407-416.
[5]李志鹏. 玉米蔗糖转运载体（ZmSUT2和ZmSUT4）的基因克隆及其功能鉴定[D]. 北京：北京师范大学，2006：45-50.
[6]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：19-22.
[7]Cigan A M，Unger-Wallace E，Haug-Collet K. Transcriptional gene silencing as a tool for uncovering gene function in maize[J]. The Plant Journal，2005，43（6）：929-940.
[8]Miki D，Itoh R，Shimamoto K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J]. Plant Physiology，2005，138（4）：1903-1913.
[9]Gil-Humanes J，Pistón F，Hernando A，et al. Silencing of γ-gliadins by RNA interference （RNAi） in bread wheat[J]. Journal of Cereal Science，2008，48：565-568.
[10]Kasai M，Kanazawa A. RNA silencing as a tool to uncover gene function and engineer novel traits in soybean[J]. Breeding Science，2012，61（5）：468-479. [11]周曉婴，付三雄，陈摇松，等. 甘蓝型油菜CRABSCLAW基因克隆及其RNA干扰载体的构建[J]. 江苏农业学报，2015，31（4）：737-742.
[12]杨玛丽，赵统敏，余文贵，等. 转基因RNAi技术在番茄研究中的应用[J]. 江苏农业学报，2015，31（1）：217-221.
[13]杨玛丽，张保龙，郭佳茹，等. RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性[J]. 江苏农业学报，2014，30（5）：1102-1108.
[14]Wesley S V，Liu Q，Wielopolska A，et al. Custom knock-outs with hairpin RNA-mediated gene silencing[J]. Methods in Molecular Biology，2003，236：273-286.
[15]Wesley S V，Helliwell C A，Smith N A，et al. Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. The Plant Journal，2001，27（6）：581-590.
[16]Chincinska I A，Liesche J，Krügel U，et al. Sucrose transporter StSUT4 from potato affects flowering，tuberization，and shade avoidance response[J]. Plant Physiology，2008，146（2）：515-528.
[17]Chincinska I，Gier K，Krügel U，et al. Photoperiodic regulation of the sucrose transporter StSUT4 affects the expression of circadian-regulated genes and ethylene production[J]. Frontiers in Plant Science，2013，4（2）：26.
关键词：玉米；ZmSUT4基因；RNAi植物表达；载体构建
中图分类号：S513.03；Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0042-03
玉米的籽粒产量主要取决于籽粒形成过程中成熟叶片（源）光合产物的生产、韧皮部的运输（流）以及在籽粒（库）中的积累。光合产物的分配运输是植物体内源、流、库相互协调的结果，源足、库大、流畅是高产的基础[1-2]。目前对源、库的特性研究较多，但是由于受研究方法和条件等限制，如对DNA序列了解的限制，对流的了解还相当不足。研究发现，随着种植密度增加，收获指数快速下降，表明在较高密度条件下，流对产量的限制作用在增加[3]。流包括韧皮部的装载、筛管中运输、韧皮部卸出和同化物的重新吸收。蔗糖作为高等植物光合同化物运输的主要形式，也是联系源库之间主要的糖类[4]。细胞膜上的蔗糖转运蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）承担着蔗糖从源细胞的外运、韧皮部的装载和卸载，以及向库細胞的装入功能，从而影响蔗糖的运输方向、速率和分配，其基因表达受多种环境因子的调控。ZmSUT4是玉米体内唯一的高蔗糖转运能力SUT4亚族成员，在植物体内的蔗糖运输和分配过程中发挥着不可替代的重要作用。但是，关于玉米SUT4的研究才刚刚起步，李志鹏仅利用逆转录PCR（RT-PCR）技术检测ZmSUT4在玉米籽粒灌浆期花柄、籽粒等库器官的表达情况，未构建RNA干扰载体，分析ZmSUT4表达被抑制对植株生长发育及相关基因表达的影响[5]。本研究利用ZmSUT4基因的全长cDNA序列，构建ZmSUT4基因RNA干扰载体，为进一步研究ZmSUT4基因的生理效应及作用机制奠定基础，也为研究其他SUTs基因的功能提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
所用玉米材料为玉米优良自交系黄早四。
KAPA Hifi高保真DNA聚合酶，购自美国KAPA Biosystems公司；T4-DNA连接酶、限制性内切酶，购自NEB公司；植物总RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit（cDNA第1链合成试剂盒）、质粒小提试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京TIANGEN公司；pEASY-T、大肠杆菌DH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA marker DL2000，购自TaKaRa公司。引物合成和测序由上海立菲生物技术有限公司完成。Taq酶、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。植物表达载体pGreen-HY104质粒及含有pSoup质粒的农杆菌EHA105，均由国家玉米改良中心徐明良实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 玉米ZmSUT4基因cDNA序列的获得 利用植物总RNA提取试剂盒提取黄早四幼苗总RNA，利用反转录试剂盒获得黄早四全长cDNA序列。
1.2.2 干扰片段的选择及引物设计 根据NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上已发表的玉米ZmSUT4基因的全长cDNA序列，选择该序列上的特异片段及表达载体pGreen-HY104的限制性内切酶酶切位点，并设计引物。分别在5′端加上PstⅠ-EcoRⅠ、BamHⅠ-XhoⅠ酶切位点，引物序列为：F：5′-GCTGCAGAATTCGTCTGGAAACTCTTTGTGGGT-3′；R：5′-CGGATCCTCGAGCTCCTGTAACTTTTATTCATTGCT-3′。预期扩增片段长度为219 bp。
1.2.3 干扰片段的扩增 以全长cDNA序列为模板进行PCR扩增。反应条件为：热启动；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，无非特异性条带，则直接进行后续试验。
1.2.4 RNA干扰（RNAi）植物表达载体的构建 将PCR产物连接到T载体，获得T-ZmSUT4，将T-ZmSUT4转化大肠杆菌DH5α，于37 ℃暗培养12～16 h，进行蓝白斑筛选；挑取白色单菌落，进行PCR检测，将含有目标克隆的单菌落于 37 ℃ 摇菌过夜，送公司测序。提取包含正确序列T载体的质粒，用XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切表达载体pGreen-HY104、T-ZmSUT4质粒，回收酶切产物；用T4-DNA连接酶过夜连接，将干扰片段反向插入表达载体中，得到HY104-A，用其转化大肠杆菌，Kan抗性筛选目标克隆，提取质粒验证；用BamHⅠ、PstⅠ酶切载体HY104-A、T-ZmSUT4，回收酶切产物，过夜连接得到HY104-A-S（图1），转化大肠杆菌，Kan抗性筛选目标克隆，提取质粒，用EcoRⅠ进行验证。
1.2.5 RNAi植物表达载体转化农杆菌EHA105 采用冻融
法[6]将构建好的RNAi植物表达载体HY104-A-S转化含有pSoup质粒的农杆菌EHA105感受态细胞，涂于含有Rif（50 μg/mL）、Kan（100 μg/mL）的LB固体培养基上，28 ℃暗培养2 d。挑取阳性菌落，进行菌落PCR鉴定。 2 結果与分析
2.1 干扰片段的PCR扩增
以玉米ZmSUT4基因的cDNA序列为模板，利用携带酶切位点的特异引物进行PCR扩增，电泳检测扩增产物。由图2可知，本试验得到219 bp的片段。将该片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，菌落经PCR鉴定后，将阳性克隆送公司测序，测序结果与黄早四cDNA序列完全一致（图3）。
2.2 RNAi表达载体的构建
提取T-ZmSUT4、pGreen-HY104载体的质粒，用 XhoⅠ、EcoRⅠ对2种质粒进行双酶切，结果见图4，胶回收连接后转化到大肠杆菌DH5α中，Kan抗性筛选目标克隆，对菌落进行PCR鉴定。提取正确克隆的质粒HY104-A，利用BamHⅠ、PstⅠ酶切载体HY104-A、T-ZmSUT4，结果见图5。回收酶切产物，连接后得到HY104-A-S，转化大肠杆菌，Kan抗性筛选目标克隆，提取质粒验证，利用EcoRⅠ酶切该质粒，预测应得到约1 000 bp的小片段。图6电泳结果与预期一致，表明植物表达载体HY104-A-S构建正确。
2.3 表达载体转化根瘤农杆菌
分别以阳性对照质粒HY104-A-S和含有表达载体的农杆菌菌落为模板，利用特异性引物进行PCR扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定表明：含有表达载体的农杆菌菌液所得条带正确（图7），表明HY104-A-S载体质粒已转入含pSoup质粒农杆菌EHA105中。
3 讨论
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源或外源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）高效特异性降解与
其高度同源的mRNA，有效地阻断目的基因的表达，从而获得功能缺失的突变体，因此该技术可作为研究基因组功能、创造分子育种新材料的有效手段。目前，RNA干扰技术已在玉米、水稻、大麦、小麦、大豆和马铃薯等作物中成功应用[7-13]。Wesley等研究发现，双链RNA的长度影响目的基因的沉默效率，干扰片段长度在98～853 bp之间时基因沉默效率较高[14-15]。此外，在插入的正向与反向干扰片段之间应有适当长度的间隔序列，以便RNAi表达载体在转入玉米后形成含有发夹结构的dsRNA，进而干扰ZmSUT4基因的表达。
Chincinska等利用RNA干扰技术研究发现，与野生型植株相比，马铃薯StSUT4-RNAi植株源叶中蔗糖输出增加，促使蔗糖、淀粉在块茎等库器官大量积累，进而引起块茎产量增加[16-17]。本研究成功构建了玉米ZmSUT4基因的RNAi植物表达载体，不但为探究ZmSUT4基因表达在源库互作中的功能奠定了基础，还为进一步研究蔗糖运输、分配的调节机制提供理论依据，也为利用转基因技术调节蔗糖的运输、分配，从而提高玉米籽粒产量提供参考。
参考文献：
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[6]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：19-22.
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[8]Miki D，Itoh R，Shimamoto K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J]. Plant Physiology，2005，138（4）：1903-1913.
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[10]Kasai M，Kanazawa A. RNA silencing as a tool to uncover gene function and engineer novel traits in soybean[J]. Breeding Science，2012，61（5）：468-479. [11]周曉婴，付三雄，陈摇松，等. 甘蓝型油菜CRABSCLAW基因克隆及其RNA干扰载体的构建[J]. 江苏农业学报，2015，31（4）：737-742.
[12]杨玛丽，赵统敏，余文贵，等. 转基因RNAi技术在番茄研究中的应用[J]. 江苏农业学报，2015，31（1）：217-221.
[13]杨玛丽，张保龙，郭佳茹，等. RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性[J]. 江苏农业学报，2014，30（5）：1102-1108.
[14]Wesley S V，Liu Q，Wielopolska A，et al. Custom knock-outs with hairpin RNA-mediated gene silencing[J]. Methods in Molecular Biology，2003，236：273-286.
[15]Wesley S V，Helliwell C A，Smith N A，et al. Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. The Plant Journal，2001，27（6）：581-590.
[16]Chincinska I A，Liesche J，Krügel U，et al. Sucrose transporter StSUT4 from potato affects flowering，tuberization，and shade avoidance response[J]. Plant Physiology，2008，146（2）：515-528.
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