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【摘 要】目的:建立三维细胞培养技术(TDCC)在流感病毒培养中的方法。方法:尝试建立三维细胞培养技术在流感病毒培养中的方法,并比较三维细胞培养技术与传统贴壁细胞培养技术传代细胞得率及病毒培养效果及三维细胞培养方法对于流感病毒核酸分型检测的有效性。结果:三维细胞培养技术在细胞传代得率是贴壁细胞培养技术6.67倍,传代后细胞用作病毒培养效果比较差异并不明显(P > |t| = 0.5943),流感核酸未分型标本的三维细胞培养比普通贴壁培养更快速有利于核酸分型检测。结论:三维细胞培养技术将具有三维结构不同材料的载体与MDCK细胞在体外共同培养,构成三维的细胞-载体复合物],使得细胞生长有效面积远高于贴壁细胞培养技术,使细胞传代中细胞得率远高于贴壁细胞培养,三维细胞培养的收获的细胞与贴壁细胞培养收获后的细胞用于流感病毒培养效果并没有明显差异,利用三维构架下染毒的方法来提高病毒培养物效价和对于核酸未分型标本的检测有一定的应用价值。
【关键词】三维细胞培养;流感病毒;监测
【中图分类号】R372 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484(2013)09—0118—01
2009年5月,新甲型H1N1病毒造成世界范围内的大流行,2013年春季在中国长三角地区流行甲型H7N9流感病毒,加强对流感病毒监测对于疫情分析、流行趋势研判、疫苗研制等方面有着极其重要的意义。目前国内在流感病毒监测方面主要采用核酸检测和单层贴壁细胞培养技术。由于标本采集的问题及细胞在体外环境下生长逐渐丧失了原有的性状[1],在很多情况下,所取到的研究结果和实际结果不符合。传统单层细胞培养得率过低是大量病毒监测工作中难以突破的的瓶颈。我们建立了三维细胞培养技术方法在流感病毒的网络监测中得到较好的应用。
1 材料与方法
1.1 样本采集:上海市黄浦区流感网络监测定点医院(第二人民医院)流感监测点于2013年1-2月冬春季采集的类流感病例鼻咽拭子合计76份。
1.2 核酸抽提:取鼻咽拭子病毒采样液140微升,使用QIACUBE?核酸抽提仪,试剂使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit(250)试剂盒提取病毒RNA。
1.3 流感病毒核酸检测:Real-Time RT- PCR检测使用上海之江生物技术有限公司甲型流感病毒核酸检测试剂盒(A型/B型流感核酸检测试剂盒、H1、H3、H1N1(2009pdm)型核酸检测试剂盒),PCR扩增仪使用国产上海宏石SLAN荧光定量PCR扩增仪。反应条件如下:45 ℃ 10 min逆转录,95 ℃ 15 min变性,95 ℃ 15s,60℃ 1min FAM通道检测荧光,40个循环。
1.4三维细胞培养
1.4.1培养仪:采用Hamilton?公司的BioLevitator?三维细胞培养仪。
1.4.2细胞来源:75mL细胞培养瓶复苏的狗肾细胞(MDCK),消化后得到悬浮细胞。将悬浮细胞接种到GEM微载体上,在培养设备上运行接种程序。当细胞生长覆盖率达到80%以上时,加入两倍量的新的GEM微载体。继续培养,在培养过程中根据需要更换新的培养基。当细胞生长覆盖率达到80%以上时,将培养管内溶液分装到三个新的培养管中。向三管中分别加入两倍于原体积的新培养基和两倍于原数量的GEM微载体。在培养设备上运行接种程序。
1.4.3细胞生长:当细胞生长覆盖率达到80%以上时,取出培养管,用磁铁吸住GEM微载体,移去培养基。用3-Dissolution试剂将GEM微载体溶解,用磁铁吸去磁性颗粒,得到细胞。转移细胞溶液至新的50mL管中,将细胞清洗、悬浮后细胞分装并计数。细胞样品可以用于下游的检测或其它应用。
1.4.4接种病毒
1.4.4.1接种中毒:当细胞生长覆盖率达到要求后,开始进行病毒感染实验。采用上述9份季节性流感病毒H3核酸检测阳性标本分A、B组进行染毒试验。A组为贴壁细胞培养的细胞,B组为三维细胞培养的细胞。置37?C, 7.5% CO2浓度培养,每天观察,当有90%的细胞出现CPE后,进行收毒。
1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管,在1,000-2,000转下离心10mins,以此除去细胞碎片,将离心后的上清夜轉移,弃底部沉淀,该上清液进行病毒滴度测定。
1.4.5 三维细胞培养细胞的观察与计数
1.4.5.1取50μL培养液(cells on GEM?)至96孔板中的一个孔内。加入100μL Hoechst 33342溶液到该孔内。室温下放置15-20分钟。用显微镜在紫外和DAPI滤光片下观察。
1.4.5.2细胞计数用CubeMagnet将剩余的400μL细胞样品中的生长在GEM上的细胞吸附到底部。用移液器将培养基移除。加入1mL PBS到样品中。在CubeMagnet帮助下,移除PBS缓冲液。加入200μL 3-Dissolution到样品中。37?C孵育10-15分钟,用显微镜观察直到GEM被完全溶解。将盖玻片平铺在血细胞计数器上。加入50μL Trypan Blue和50μL细胞样品到微离心管中。盖上盖子混匀。取10μL细胞/Trypan Blue混合物到盖玻片下面。用血细胞计数器对活/死细胞进行计数。
1.5 MDCK单层细胞培养:参照中国国家流感中心实验室流感病毒监测方案操作方法。[2]
1.6 血凝试验方法:参照中国国家流感中心实验室流感病毒监测方案操作方法。[2]
1.7 结果的统计与分析使用统计学软件stata 7.0。
2 结果
2.1 标本直接核酸检测结果:经RT-PCR筛查甲型流感核酸阳性标本9份,阳性率为11.8%(9/76)。其中H3分型阳性6例,未分型(包含H1、H3、H1N1(2009pdm))共3例。CT值分别为29.2,31.2,32.1,33.2,35.2,37.5 。 2.2细胞生长效率比较:75mL细胞瓶狗肾细胞(MDCK)工作容量为10mL,细胞总数为2*106个。传统贴壁细胞培养传代一次可以得到9瓶25mL细胞瓶的狗肾细胞用于病毒培养,其工作容量约为18毫升单位细胞数2.5*105个/mL,得到的细胞总数约为4.5*106个。利用三维细胞培养技术计数培养后可以得到4瓶40mL细胞悬液。用细胞计数板5次,结果见表一。 计算公式:总细胞数=单格细胞计数*104*160/ml。
2.3 接种中毒后血凝效价比较:用9份甲型流感病毒病毒核酸阳性标本,采样液染毒后血凝效价测定结果见表二,A组为单层细胞贴壁培养中毒,B组为三维细胞培养后中毒实验。
以上结果用几何均数配对T检验统计分析,结果P > |t| = 0.5943,显示三维培养传代细胞的染毒实验滴度与贴壁细胞培养的细胞中毒后血凝试验效价结果无显著性差异。
2.4 甲型流感病毒细胞培养后核酸检测结果比较:将9例经直接检测甲型流感核酸阳性标本分别接种三维培养和贴壁培养的MDCK细胞,CO2培养,观察中毒后,重新抽核酸进行核酸分型检测,均为H3型季节性流感。结果见表三。A组为单层细胞贴壁培养中毒液检测,B组为三维细胞培养后中毒液检测。
以上结果用配对T检验统计分析,结果P > |t| = 0.3956,贴壁细胞培养和三维细胞培养结果无显著性差异;细胞培养后病毒大量增殖,使得核酸分型检测结果更明确。
3 讨论
流感病毒的监测包括核酸检测和细胞培养两方面。细胞培养是对流感病毒对细胞的敏感性,抗原性分析的必须方法,也可以通过细胞中毒实验使得某些直接核酸檢测结果不明确的标本得以明确病毒核酸的分类,通过较少病毒载量的标本在细胞中增殖也是对一些不明分类的流感病毒深入研究的基础。
三维细胞培养技术在细胞培养上更贴近于自然状态,细胞生物活性较高。[3]利用该技术得到细胞对已病毒培养更为高效。三维细胞培养技术可以在病毒培养中得到极大的发展。对于三维结构下细胞生物活性较高状态的细胞染毒实验可能大大提高流感病毒染毒效果。得益于三维培养技术的革新,使得该技术能够培养在传统培养板上难以培养的细胞;细胞生长状态更加接近于体内状态,利于细胞的极化与功能化[4];省去消化、离心等操作,简化细胞培养流程;可以在短时间内获得大量细胞;细胞的一致性可以得到保障;微载体透光性好,没有自发荧光,不必与细胞分离就可以进行后续观测;细胞培养表面大,可以获得高密度细胞;微载体材质与结构适合细胞生长,表面提供各种蛋白包被可满足特殊细胞培养的需求;微载体内嵌磁性颗粒,便于外加磁力进行操控;大大减少耗材用量,降低耗材成本,并且有利于环保;减少研究者在细胞培养上花费的精力。
本次研究中,三维细胞培养方法不仅比普通单层细胞培养有更多的细胞收获,而且在病毒敏感性,血凝效价实验等各方面与单层细胞培养方法无显著性差异。
三维细胞培养技术在流感病毒培养中得以较好的应用,该技术在细胞传代、细胞复苏、细胞冻存等细胞技术都已经较为成熟。特别是细胞传代的应用,细胞培养技术与新材料新方法结合的全新思路解决和突破了传统贴壁细胞培养技术细胞传代细胞得率过低的技术瓶颈,对于我们实验室高通量的流感病毒监测、培养具有十分重要的意义。
参考文献:
[1] 胡康洪, 姚颖.三维细胞培养技术的研究与应用, 医学分子生物学杂志, 2008, 5(2):185-188
[2] 全国流感监测方案(2010版)
[3] ALVIA,STUPACK D G,Cell survival in a three-dimensional matrix[J].Methods Enzymol,2007,426:85-101.
[4] 盛治国, 郭家彬, 彭双清. 体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用, 中国药理学与毒理学杂志, 2007. 21 (5)
作者简介:
陈军,性别:男,出生年月:1973年10月、籍贯:浙江宁波、职务:上海市黄浦区疾病预防控制中心分子生物学实验室主任、职称:主管技师、学历:本科、研究方向:微生物检验、工作单位:上海市黄浦区疾病预防控制中心。
【关键词】三维细胞培养;流感病毒;监测
【中图分类号】R372 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484(2013)09—0118—01
2009年5月,新甲型H1N1病毒造成世界范围内的大流行,2013年春季在中国长三角地区流行甲型H7N9流感病毒,加强对流感病毒监测对于疫情分析、流行趋势研判、疫苗研制等方面有着极其重要的意义。目前国内在流感病毒监测方面主要采用核酸检测和单层贴壁细胞培养技术。由于标本采集的问题及细胞在体外环境下生长逐渐丧失了原有的性状[1],在很多情况下,所取到的研究结果和实际结果不符合。传统单层细胞培养得率过低是大量病毒监测工作中难以突破的的瓶颈。我们建立了三维细胞培养技术方法在流感病毒的网络监测中得到较好的应用。
1 材料与方法
1.1 样本采集:上海市黄浦区流感网络监测定点医院(第二人民医院)流感监测点于2013年1-2月冬春季采集的类流感病例鼻咽拭子合计76份。
1.2 核酸抽提:取鼻咽拭子病毒采样液140微升,使用QIACUBE?核酸抽提仪,试剂使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit(250)试剂盒提取病毒RNA。
1.3 流感病毒核酸检测:Real-Time RT- PCR检测使用上海之江生物技术有限公司甲型流感病毒核酸检测试剂盒(A型/B型流感核酸检测试剂盒、H1、H3、H1N1(2009pdm)型核酸检测试剂盒),PCR扩增仪使用国产上海宏石SLAN荧光定量PCR扩增仪。反应条件如下:45 ℃ 10 min逆转录,95 ℃ 15 min变性,95 ℃ 15s,60℃ 1min FAM通道检测荧光,40个循环。
1.4三维细胞培养
1.4.1培养仪:采用Hamilton?公司的BioLevitator?三维细胞培养仪。
1.4.2细胞来源:75mL细胞培养瓶复苏的狗肾细胞(MDCK),消化后得到悬浮细胞。将悬浮细胞接种到GEM微载体上,在培养设备上运行接种程序。当细胞生长覆盖率达到80%以上时,加入两倍量的新的GEM微载体。继续培养,在培养过程中根据需要更换新的培养基。当细胞生长覆盖率达到80%以上时,将培养管内溶液分装到三个新的培养管中。向三管中分别加入两倍于原体积的新培养基和两倍于原数量的GEM微载体。在培养设备上运行接种程序。
1.4.3细胞生长:当细胞生长覆盖率达到80%以上时,取出培养管,用磁铁吸住GEM微载体,移去培养基。用3-Dissolution试剂将GEM微载体溶解,用磁铁吸去磁性颗粒,得到细胞。转移细胞溶液至新的50mL管中,将细胞清洗、悬浮后细胞分装并计数。细胞样品可以用于下游的检测或其它应用。
1.4.4接种病毒
1.4.4.1接种中毒:当细胞生长覆盖率达到要求后,开始进行病毒感染实验。采用上述9份季节性流感病毒H3核酸检测阳性标本分A、B组进行染毒试验。A组为贴壁细胞培养的细胞,B组为三维细胞培养的细胞。置37?C, 7.5% CO2浓度培养,每天观察,当有90%的细胞出现CPE后,进行收毒。
1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管,在1,000-2,000转下离心10mins,以此除去细胞碎片,将离心后的上清夜轉移,弃底部沉淀,该上清液进行病毒滴度测定。
1.4.5 三维细胞培养细胞的观察与计数
1.4.5.1取50μL培养液(cells on GEM?)至96孔板中的一个孔内。加入100μL Hoechst 33342溶液到该孔内。室温下放置15-20分钟。用显微镜在紫外和DAPI滤光片下观察。
1.4.5.2细胞计数用CubeMagnet将剩余的400μL细胞样品中的生长在GEM上的细胞吸附到底部。用移液器将培养基移除。加入1mL PBS到样品中。在CubeMagnet帮助下,移除PBS缓冲液。加入200μL 3-Dissolution到样品中。37?C孵育10-15分钟,用显微镜观察直到GEM被完全溶解。将盖玻片平铺在血细胞计数器上。加入50μL Trypan Blue和50μL细胞样品到微离心管中。盖上盖子混匀。取10μL细胞/Trypan Blue混合物到盖玻片下面。用血细胞计数器对活/死细胞进行计数。
1.5 MDCK单层细胞培养:参照中国国家流感中心实验室流感病毒监测方案操作方法。[2]
1.6 血凝试验方法:参照中国国家流感中心实验室流感病毒监测方案操作方法。[2]
1.7 结果的统计与分析使用统计学软件stata 7.0。
2 结果
2.1 标本直接核酸检测结果:经RT-PCR筛查甲型流感核酸阳性标本9份,阳性率为11.8%(9/76)。其中H3分型阳性6例,未分型(包含H1、H3、H1N1(2009pdm))共3例。CT值分别为29.2,31.2,32.1,33.2,35.2,37.5 。 2.2细胞生长效率比较:75mL细胞瓶狗肾细胞(MDCK)工作容量为10mL,细胞总数为2*106个。传统贴壁细胞培养传代一次可以得到9瓶25mL细胞瓶的狗肾细胞用于病毒培养,其工作容量约为18毫升单位细胞数2.5*105个/mL,得到的细胞总数约为4.5*106个。利用三维细胞培养技术计数培养后可以得到4瓶40mL细胞悬液。用细胞计数板5次,结果见表一。 计算公式:总细胞数=单格细胞计数*104*160/ml。
2.3 接种中毒后血凝效价比较:用9份甲型流感病毒病毒核酸阳性标本,采样液染毒后血凝效价测定结果见表二,A组为单层细胞贴壁培养中毒,B组为三维细胞培养后中毒实验。
以上结果用几何均数配对T检验统计分析,结果P > |t| = 0.5943,显示三维培养传代细胞的染毒实验滴度与贴壁细胞培养的细胞中毒后血凝试验效价结果无显著性差异。
2.4 甲型流感病毒细胞培养后核酸检测结果比较:将9例经直接检测甲型流感核酸阳性标本分别接种三维培养和贴壁培养的MDCK细胞,CO2培养,观察中毒后,重新抽核酸进行核酸分型检测,均为H3型季节性流感。结果见表三。A组为单层细胞贴壁培养中毒液检测,B组为三维细胞培养后中毒液检测。
以上结果用配对T检验统计分析,结果P > |t| = 0.3956,贴壁细胞培养和三维细胞培养结果无显著性差异;细胞培养后病毒大量增殖,使得核酸分型检测结果更明确。
3 讨论
流感病毒的监测包括核酸检测和细胞培养两方面。细胞培养是对流感病毒对细胞的敏感性,抗原性分析的必须方法,也可以通过细胞中毒实验使得某些直接核酸檢测结果不明确的标本得以明确病毒核酸的分类,通过较少病毒载量的标本在细胞中增殖也是对一些不明分类的流感病毒深入研究的基础。
三维细胞培养技术在细胞培养上更贴近于自然状态,细胞生物活性较高。[3]利用该技术得到细胞对已病毒培养更为高效。三维细胞培养技术可以在病毒培养中得到极大的发展。对于三维结构下细胞生物活性较高状态的细胞染毒实验可能大大提高流感病毒染毒效果。得益于三维培养技术的革新,使得该技术能够培养在传统培养板上难以培养的细胞;细胞生长状态更加接近于体内状态,利于细胞的极化与功能化[4];省去消化、离心等操作,简化细胞培养流程;可以在短时间内获得大量细胞;细胞的一致性可以得到保障;微载体透光性好,没有自发荧光,不必与细胞分离就可以进行后续观测;细胞培养表面大,可以获得高密度细胞;微载体材质与结构适合细胞生长,表面提供各种蛋白包被可满足特殊细胞培养的需求;微载体内嵌磁性颗粒,便于外加磁力进行操控;大大减少耗材用量,降低耗材成本,并且有利于环保;减少研究者在细胞培养上花费的精力。
本次研究中,三维细胞培养方法不仅比普通单层细胞培养有更多的细胞收获,而且在病毒敏感性,血凝效价实验等各方面与单层细胞培养方法无显著性差异。
三维细胞培养技术在流感病毒培养中得以较好的应用,该技术在细胞传代、细胞复苏、细胞冻存等细胞技术都已经较为成熟。特别是细胞传代的应用,细胞培养技术与新材料新方法结合的全新思路解决和突破了传统贴壁细胞培养技术细胞传代细胞得率过低的技术瓶颈,对于我们实验室高通量的流感病毒监测、培养具有十分重要的意义。
参考文献:
[1] 胡康洪, 姚颖.三维细胞培养技术的研究与应用, 医学分子生物学杂志, 2008, 5(2):185-188
[2] 全国流感监测方案(2010版)
[3] ALVIA,STUPACK D G,Cell survival in a three-dimensional matrix[J].Methods Enzymol,2007,426:85-101.
[4] 盛治国, 郭家彬, 彭双清. 体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用, 中国药理学与毒理学杂志, 2007. 21 (5)
作者简介:
陈军,性别:男,出生年月:1973年10月、籍贯:浙江宁波、职务:上海市黄浦区疾病预防控制中心分子生物学实验室主任、职称:主管技师、学历:本科、研究方向:微生物检验、工作单位:上海市黄浦区疾病预防控制中心。