论文部分内容阅读
摘 要：以红曲黄色素为实验材料，采用薄膜分散法制备红曲黄色素脂质体。在单因素实验下，利用4因素3水平的Box-Behnken8.0.6对红曲黄色素脂质体的包封率进行优化设计分析，结果表明：红曲黄色素脂质体的最佳工艺条件为，药脂比为1∶20.4，超声提取时间36.8min，膜材比为4.32∶1，水化温度41.2℃，在此条件下包封率为61.4%，与响应面预测值（62.57%）的相对误差为1.8%，实验可靠;抗氧化性实验表明红曲黄色素脂质体能够在一定程度上有效的清除DPPH的自由基，稳定性较好。
关键词：红曲黄色素;薄膜分散法;响应面;抗氧化性
中图分类号 TS202 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）20-0118-06
Abstract：Use red yeast pigment，soy lecithin，cholesterol as the main experimental raw material，Monascus pigment liposome prepared by thin film dispersion method，Under the operation of single factor experiment，the encapsulation efficiency of Monascus pigment liposome was optimized by using the Box-Behnken center experiment of 4 factors and 3 levels. The experiment showed that the optimal process conditions of Monascus pigment liposome The ultrasonic extraction time was 36.8 min，the hydration temperature was 41.2°C，the membrane ratio was 4.32∶1，the ratio of drugw to lipid was 1∶20.4，the predicted surface response was 0.6257，and the actual verification value was 0.614. The relative error was 1.8%.The results of experiment is reliable.Antioxidant experiments showed that monascus yellow liposome can effectively remove DPPH free radicals to some extent.
Key words：Red Yeast Yellow Pigment;Water Soluble Pigment;Response Surface;Stability
引言
紅曲色素是聚酮类化合物的总称，是红曲菌在代谢过程中产生的次级代谢产物[1]。红曲色素作为可食用色素，常被用作食品染色剂和膳食材料，主要用作于食品、中药、调味品、酿酒行业中[2]。红曲黄色素是红曲黄霉通过次级代谢产生的结构与洛伐他汀相似的聚酮类化合物，而洛伐他汀在全球范围内被公认为具有降低胆固醇的作用，因此，红曲黄色素在一定程度上能够起到降低人体血脂含量的作用[3]。
脂质体可以同时包埋具有疏水性和亲水性的物质，它具有类双分子层的闭合囊状结构，能够将药物包裹在内部[4]，对靶组织有高度的选择性，具有一定的药物靶向性，能够起到降低毒副作用，提高疗效[5]，且有一定的缓释作用，常被用作是药物的递送系统[6]。
本实验拟采用薄膜分散法制备红曲黄色素脂质体，确定红曲黄色素脂质体的最优制备方案，以红曲黄色素脂质体包封率为综合考察指标，以期得到一种简单有效的制备方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 红曲黄色素（AR，上海源叶生物科技有限公司）、大豆卵磷脂（上海虹泉生物科技有限公司，纯度[≥]97%）、胆固醇、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠三氯甲烷、石油醚、无水乙醇（均为分析纯）、一级纯化水（实验室自制）。
1.2 仪器与设备 H4-20KR高速冷冻离心机（安徽中华中佳科学仪器有限公司）、电子天平AB323（上海海康电子仪器厂）、旋转蒸发仪RE-2000B（巩义市予华仪器有限责任公司）、TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、J数显恒温水浴锅HH-1（浦怡电子科技有限公司）、K-500DB型数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）、超纯水机G1410005（重庆摩尔水处理设备有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 工艺流程 按比例称取一定量的大豆卵磷脂和胆固醇→加入相应量的红曲黄色素→超声→旋蒸→水化→孵化。
1.3.2 标准曲线的建立 由文献得知红曲黄色素在波长为500nm附近有吸收峰[7]，准确称取红曲黄色素0.1mg溶于无水乙醇中，并超声处理30min，进行波长扫描，在波长为460nm处有最大吸收峰。
精确称取0.010g红曲黄色素标准品，加入乙醇充分溶解后，用无水乙醇进行定容至100mL;从中取得10mL溶液再加入无水乙醇使其定容到100mL摇匀;既得0.01mg/mL的红曲黄色素标准溶液;依照上述操作再分别配制浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的红曲黄色素溶液，然后再460nm波长处测定吸光度（无水乙醇为空白对照），绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.438x-0.022，R2=0.9988，见图1。 1.3.3 包封率的计算 将制备好的脂质体悬浮液移取1mL，用甲醇定容到25mL，静置3h测得吸光度M总，悬浮液在转速为10000rpm/min的速度下离心30min，按照项1.3.2测得上清液的吸光度，得游离的红曲黄色素[M1]，包封率公式见公式1。
包封率=[M总-M1M总]×100 （1）
式中：[M1]为游离的红曲黄色素浓度，[M总]为红曲黄色素的总浓度。
1.3.4 单因素实验 （1）膜材比：精确称取1.0000g大豆卵磷脂，按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的比例分别称取6份胆固醇，按照大豆卵磷脂∶红曲黄=20∶1的比例称取0.05g红曲黄，加入20mL氯仿，超声30min，悬蒸，水化，孵化温度45℃，分别经离心后按项1.3.2测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，平行3次。（2）药脂比：精准称取1.0000g大豆卵磷脂6份，称取0.25g胆固醇6份，按照红曲黄色素∶大豆卵磷脂的比例分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30称取红曲黄，加入20mL氯仿，超声30min，悬蒸，水化，辅化温度45℃，分别经离心后按项1.3.2测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，每组实验重复3次。（3）超声时间：精确称取1.0000g大豆卵磷脂6份，按照大豆卵磷脂∶胆固醇∶红曲黄=20∶5∶1的比例称取0.25g胆固醇和0.05g红曲黄，加入20mL氯仿，分别置于时间为25min、30min、35min、40min、45min条件下进行超声处理，悬蒸，水化，辅化温度45℃，分别经离心后测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，每组实验重复3次。（4）水化温度：精确称取1.0000g大豆卵磷脂6份，按照大豆卵磷脂∶胆固醇∶红曲黄=20∶5∶1的比例称取0.25g胆固醇和0.05g红曲黄，加入20mL氯仿，超声处理40min，悬蒸，分别在温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的条件下水化，分别经离心和破乳后测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，每组实验重复3次。
1.3.5 响应面法优化提取工艺 根据单因素实验结果数据分析可以得出药脂比、膜材比、超声时间、水化温度对脂质体的包封率影响较为明显，采取Box-Benhnken设计[8]应面实验以药脂比、膜材比、超声时间、水化温度作为自变量，以红曲黄色素的包封率为实验结果，表1为实验因素的水平编码表。
1.3.6 验证试验 通过响应面优化设计后的实验结果进行数据分析，可以得到最佳的脂质体的制备条件，并重复实验3次，取得3次试验的平均值与模型预测的理论值相比较。
1.3.7 抗氧化性试验 有文献表明包封率较低的脂质体能够清除DPPH自由基的能力比包封率较高的脂质体清除DPPH自由基的能力较低[9]的实际情况，通过测定DPPH的清除力来测定红曲黄色素脂质体的抗氧化活性。精确吸取1mL样品（红曲黄色素脂质体、空白脂质体），加入2mLDPPH乙醇溶液混合均匀，在光线阴暗处使其反应40min，于波长520nm处测得上清液吸光度A1，用PBS缓冲液代替空白样测得吸光度A2，用乙醇溶液替代DPPH测得吸光度A3，计算公式如下：
DPPH自由基清除率（%）=[1-A1-A3A2×10]0 （2）
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 药脂比的影响 如图2所示，当药脂比（1∶X）在不断减小时，脂质体的包封率呈现1个上升的趋势，并在药脂比为1∶20时，包封率达到最高，可能的原因是由于一开始药物的投入量比较高，使得药物超出了脂质体的最大药物负荷量，不能有效地包裹住所有的药物，从而使得游离中的药物的浓度过大，导致脂质体的包封率较低;也有可能是胆固醇和大豆卵磷脂的浓度过高，使得脂质体发生聚集，降低了脂质体的稳定性，使得药物发生渗漏。后来随着药脂比的不断减小，脂质体的包封率出现1个明显下降的趋势，可能的原因是随着药脂比的不断减小，脂质体包含药物的有效含量过低[10]，测得的吸光度和离心后上清液的吸光度相差不大，导致包封率较小。
2.1.2 膜材比的影响 如图3所示，当膜材比（1∶X）逐渐增大时，包封率呈现1个上升的趋势，前段包封率低可能是由于大豆卵磷脂的含量过多，在水化的过程中比较困难，卵磷脂容易凝聚[11]，后来随着膜材比的逐渐增大，使得大豆卵磷脂的相对含量降低，包封率上升，并且在膜材比为4∶1时，达到了最大值，后来随着胆固醇的量增大到一定程度时，脂质体膜的亲水性较强，脂质体相互聚集使得膜易被破壞，包裹住的药物比较容易发生渗漏，导致包封率较低。
2.1.3 超声时间的影响 如图4所示，超声时间在25-40min的过程中，脂质体的包封率呈现1个上升的状态，且在超声时间为40min时达到最大值，可能是由于超声的有效时间过短，使脂质体不能均匀分散开来，脂质体相互聚集导致膜易破碎，药物流失严重，随着超声时间的逐渐加长，包封率呈现1个下降的趋势，应该是由于超声本身所具有的热效应导致的温度上升使得脂质体膜易被破坏[12]，还有可能就是超声时间过长，使得脂质氧化，药物渗漏，造成包封率下降。
2.1.4 水化温度的影响图 如图5所示，当温度由25℃逐渐上升到40℃时，包封率呈现1个明显的上升状态，且在40℃左右时，脂质体的稳定性较好，包封率较高;温度>40℃时，可能是由于温度过高加速了磷脂的氧化，药物的稳定性较差，使得脂质体膜易破碎，导致药物的流出。包封率下降[13]。
2.2 响应面法设计及结果
2.2.1 响应面优化实验结果 根据单因素实验，利用Box-Behnken实验设计原理，实验结果分析如表2所示。
在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken实验设计原理，选取药脂比，膜材比，超声时间和水化温度为自变量，红曲黄色素的包封率为响应值。利用软件Design Expert 8.0.6，对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到红曲黄色素包封率和实验变量A、B、C、D二次回归方程： Y=62.0+0.39A+1.20B-1.57C+3.79D-9.43A2-7.07B2-9.35C2-7.96D2
由表3显示，A、B、C、D 4个因素对该模型的影响作用大小为D>C>B>A，该回归模型较为显著（P=0.0003<0.01），模型失拟项P=0.3390>0.05，且失拟项不显著，说明该模型的建立和试验数据的模拟程度一般。并且在通过Box-behnken软件分析得到红曲黄色素脂质体制备的最佳工艺参数为超声提取时间36.8min，超声提取温度49.6℃，膜材比为4.32∶1，药脂比为1∶20.4。在最优提取条件下，红曲黄色素脂质体的包封率为62.572%。
3.2.2 等高线图和响应曲面图分析 如图6所示，当超声时间为36.8min，水化温度为49.6℃时，通过分析最佳工艺条件可以得出，当药脂比在1∶15～1∶20.4的区域范围内，膜材比在3∶1～4.32∶1的区域内脂质体的包封率随着膜材比和药脂比的变化而不断上升，但上升趋势较为缓慢，当药脂比为20.4∶1时，膜材比为4.32∶1时，脂质体的包封率达到最大值。
如图7所示，当超声时间为36.8min，膜材比为4.32∶1时，通过分析最佳工艺条件可以得出，当药脂比在1∶15～1∶20.4的区域范围内，水化温度在35℃～49.6℃的区域范围内，脂质体的包封率随着水化温度和药脂比的变化而不断上升，但上升趋势较为缓慢，当药脂比为20.4∶1时，水化温度为49.6℃时，脂质体的包封率达到最大值。
如图8所示，当超声时间为36.8min，膜材比为4.32∶1时，通过分析最佳工艺条件可以得出，当药脂比在1∶15～1∶20.4的区域范围内，水化温度在35℃～49.6℃的区域范围内，脂质体的包封率随着水化温度和药脂比的变化而不断上升，但上升趋势较为缓慢，当药脂比为20.4∶1时，水化温度为49.6时，脂质体的包封率达到最大值。
1.3.3 验证性实验 由表4可知，为验证模型可靠性，再用上述优化的最佳提取条件和考虑实际情况后，采用超声时间36.8min，水化温度41℃，药脂比为1∶20.4，膜材比为4.32∶1进行实验，实际验证包封率的平均值为61.4%，相对误差为1.8%。表明该模型能够真实反映出各因素对红曲黄色素脂质体包封率的影响，因此该回归模型具有一定的真实的可靠性。
2.3 抗氧化性试验 由图9可知，在反应时间为40min的情况下，红曲黄色素脂质体能够有效地抑制DPPH自由基的产生，随着加入的溶液体积越大，清除率就越大，同时在反应过程中应注意此反应全过程应在光线阴暗处进行。
3 结论
本实验采用薄膜分散法对红曲黄色素脂质体进行制备，以膜材比、药脂比、超声时间、水化温度为单因素进行实验，其中药脂比大小对脂质体的包封率影响最大，在此基础上进行了4因素3水平的Box-Behnken实验设计，得到红曲黄色素的最佳提取工艺为药脂比为1∶20.4，水化温度41.2℃，超声时间36.8min，膜材比为4.32∶1。在此提取条件下，预测红曲黄色素脂质体的包封率为62.572%，通过实际操作，选择水化温度为41℃，超声时间为36min，膜材比为4.3∶1，药脂比为1∶20进行实验，重复3次实验得到包封率為61.4%，相对误差1.8%，结果表明，实验模拟的拟合程度一般，说明预测的优化工艺合理，且根据DPPH的抗氧化试验结果可知，红曲黄色素脂质体的稳定较好。
参考文献
[1]张婵，杨强，张桦林，等.超声辅助法优化提取红曲黄红、红曲黄色素[J].食品与生物技术学报，2014，33（08）：805-813.
[2]周容，王奕芳，李良，等.红曲黄在酿酒行业中的应用进展[J].酿酒，2018，45（05）：23-28.
[3]米佳，禄璐，罗青，等.枸杞玉米黄素双棕榈酸酯脂质体的制备及其体外抗氧化活性[J].食品工业科技，2019，40（04）：195-199，20
[4]张斌.不同磷脂膜材对脂质体稳定性的影响[D].郑州：河南工业大学，2016.
[5]方晓旭.硬脂醇半乳糖苷修饰阿西替尼脂质体的制备及体外抗肝癌活性的初步研究[D].锦州：锦州医科大学，2017.
[6]张波.基于脂质纳米载体共递送奥沙利铂及伊立替康用于增强结直肠癌治疗的研究[D].济南：山东大学，2017.
[7]黄娟，姚若一，黄邵培，等.红曲黄霉产色素和桔霉素影响因素的研究进展[J].酿酒科技，2018（02）：109-112.
[8]夏鸿熙.VD3脂质体的制备及其体内外抑制光老化活性初步研究[D].长春：吉林大学，2017.
[9]钱敏，梁彬霞，白卫东，等.红曲色素提取及分离纯化研究[J].中国调味品，2012，37（03）：17-21.
[10]田菊霞，解宇，杨艳宏.薄膜分散-超声法制备BMPs磁性脂质体[J].健康研究，2012，32（01）：1-3.
[11]李然，陈璐，齐娟，等.南极冰藻DNA光修复酶脂质体的制备及其质量评价[J].化学与生物工程，2017，34（10）：25-31.
[12]周伟华.纳米脂质载体的制备与应用研究[D].长沙：中南大学，2008.
[13]谭强来，曾臻，武晓丽，等.几种果渣提取物抗氧化能力的比较研究[J].中国食物与营养，2019，25（04）：49-52.
（责编：杨 林）
关键词：红曲黄色素;薄膜分散法;响应面;抗氧化性
中图分类号 TS202 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）20-0118-06
Abstract：Use red yeast pigment，soy lecithin，cholesterol as the main experimental raw material，Monascus pigment liposome prepared by thin film dispersion method，Under the operation of single factor experiment，the encapsulation efficiency of Monascus pigment liposome was optimized by using the Box-Behnken center experiment of 4 factors and 3 levels. The experiment showed that the optimal process conditions of Monascus pigment liposome The ultrasonic extraction time was 36.8 min，the hydration temperature was 41.2°C，the membrane ratio was 4.32∶1，the ratio of drugw to lipid was 1∶20.4，the predicted surface response was 0.6257，and the actual verification value was 0.614. The relative error was 1.8%.The results of experiment is reliable.Antioxidant experiments showed that monascus yellow liposome can effectively remove DPPH free radicals to some extent.
Key words：Red Yeast Yellow Pigment;Water Soluble Pigment;Response Surface;Stability
引言
紅曲色素是聚酮类化合物的总称，是红曲菌在代谢过程中产生的次级代谢产物[1]。红曲色素作为可食用色素，常被用作食品染色剂和膳食材料，主要用作于食品、中药、调味品、酿酒行业中[2]。红曲黄色素是红曲黄霉通过次级代谢产生的结构与洛伐他汀相似的聚酮类化合物，而洛伐他汀在全球范围内被公认为具有降低胆固醇的作用，因此，红曲黄色素在一定程度上能够起到降低人体血脂含量的作用[3]。
脂质体可以同时包埋具有疏水性和亲水性的物质，它具有类双分子层的闭合囊状结构，能够将药物包裹在内部[4]，对靶组织有高度的选择性，具有一定的药物靶向性，能够起到降低毒副作用，提高疗效[5]，且有一定的缓释作用，常被用作是药物的递送系统[6]。
本实验拟采用薄膜分散法制备红曲黄色素脂质体，确定红曲黄色素脂质体的最优制备方案，以红曲黄色素脂质体包封率为综合考察指标，以期得到一种简单有效的制备方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 红曲黄色素（AR，上海源叶生物科技有限公司）、大豆卵磷脂（上海虹泉生物科技有限公司，纯度[≥]97%）、胆固醇、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠三氯甲烷、石油醚、无水乙醇（均为分析纯）、一级纯化水（实验室自制）。
1.2 仪器与设备 H4-20KR高速冷冻离心机（安徽中华中佳科学仪器有限公司）、电子天平AB323（上海海康电子仪器厂）、旋转蒸发仪RE-2000B（巩义市予华仪器有限责任公司）、TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、J数显恒温水浴锅HH-1（浦怡电子科技有限公司）、K-500DB型数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）、超纯水机G1410005（重庆摩尔水处理设备有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 工艺流程 按比例称取一定量的大豆卵磷脂和胆固醇→加入相应量的红曲黄色素→超声→旋蒸→水化→孵化。
1.3.2 标准曲线的建立 由文献得知红曲黄色素在波长为500nm附近有吸收峰[7]，准确称取红曲黄色素0.1mg溶于无水乙醇中，并超声处理30min，进行波长扫描，在波长为460nm处有最大吸收峰。
精确称取0.010g红曲黄色素标准品，加入乙醇充分溶解后，用无水乙醇进行定容至100mL;从中取得10mL溶液再加入无水乙醇使其定容到100mL摇匀;既得0.01mg/mL的红曲黄色素标准溶液;依照上述操作再分别配制浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的红曲黄色素溶液，然后再460nm波长处测定吸光度（无水乙醇为空白对照），绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.438x-0.022，R2=0.9988，见图1。 1.3.3 包封率的计算 将制备好的脂质体悬浮液移取1mL，用甲醇定容到25mL，静置3h测得吸光度M总，悬浮液在转速为10000rpm/min的速度下离心30min，按照项1.3.2测得上清液的吸光度，得游离的红曲黄色素[M1]，包封率公式见公式1。
包封率=[M总-M1M总]×100 （1）
式中：[M1]为游离的红曲黄色素浓度，[M总]为红曲黄色素的总浓度。
1.3.4 单因素实验 （1）膜材比：精确称取1.0000g大豆卵磷脂，按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的比例分别称取6份胆固醇，按照大豆卵磷脂∶红曲黄=20∶1的比例称取0.05g红曲黄，加入20mL氯仿，超声30min，悬蒸，水化，孵化温度45℃，分别经离心后按项1.3.2测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，平行3次。（2）药脂比：精准称取1.0000g大豆卵磷脂6份，称取0.25g胆固醇6份，按照红曲黄色素∶大豆卵磷脂的比例分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30称取红曲黄，加入20mL氯仿，超声30min，悬蒸，水化，辅化温度45℃，分别经离心后按项1.3.2测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，每组实验重复3次。（3）超声时间：精确称取1.0000g大豆卵磷脂6份，按照大豆卵磷脂∶胆固醇∶红曲黄=20∶5∶1的比例称取0.25g胆固醇和0.05g红曲黄，加入20mL氯仿，分别置于时间为25min、30min、35min、40min、45min条件下进行超声处理，悬蒸，水化，辅化温度45℃，分别经离心后测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，每组实验重复3次。（4）水化温度：精确称取1.0000g大豆卵磷脂6份，按照大豆卵磷脂∶胆固醇∶红曲黄=20∶5∶1的比例称取0.25g胆固醇和0.05g红曲黄，加入20mL氯仿，超声处理40min，悬蒸，分别在温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的条件下水化，分别经离心和破乳后测吸光度，根据项1.3.3计算包封率，每组实验重复3次。
1.3.5 响应面法优化提取工艺 根据单因素实验结果数据分析可以得出药脂比、膜材比、超声时间、水化温度对脂质体的包封率影响较为明显，采取Box-Benhnken设计[8]应面实验以药脂比、膜材比、超声时间、水化温度作为自变量，以红曲黄色素的包封率为实验结果，表1为实验因素的水平编码表。
1.3.6 验证试验 通过响应面优化设计后的实验结果进行数据分析，可以得到最佳的脂质体的制备条件，并重复实验3次，取得3次试验的平均值与模型预测的理论值相比较。
1.3.7 抗氧化性试验 有文献表明包封率较低的脂质体能够清除DPPH自由基的能力比包封率较高的脂质体清除DPPH自由基的能力较低[9]的实际情况，通过测定DPPH的清除力来测定红曲黄色素脂质体的抗氧化活性。精确吸取1mL样品（红曲黄色素脂质体、空白脂质体），加入2mLDPPH乙醇溶液混合均匀，在光线阴暗处使其反应40min，于波长520nm处测得上清液吸光度A1，用PBS缓冲液代替空白样测得吸光度A2，用乙醇溶液替代DPPH测得吸光度A3，计算公式如下：
DPPH自由基清除率（%）=[1-A1-A3A2×10]0 （2）
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 药脂比的影响 如图2所示，当药脂比（1∶X）在不断减小时，脂质体的包封率呈现1个上升的趋势，并在药脂比为1∶20时，包封率达到最高，可能的原因是由于一开始药物的投入量比较高，使得药物超出了脂质体的最大药物负荷量，不能有效地包裹住所有的药物，从而使得游离中的药物的浓度过大，导致脂质体的包封率较低;也有可能是胆固醇和大豆卵磷脂的浓度过高，使得脂质体发生聚集，降低了脂质体的稳定性，使得药物发生渗漏。后来随着药脂比的不断减小，脂质体的包封率出现1个明显下降的趋势，可能的原因是随着药脂比的不断减小，脂质体包含药物的有效含量过低[10]，测得的吸光度和离心后上清液的吸光度相差不大，导致包封率较小。
2.1.2 膜材比的影响 如图3所示，当膜材比（1∶X）逐渐增大时，包封率呈现1个上升的趋势，前段包封率低可能是由于大豆卵磷脂的含量过多，在水化的过程中比较困难，卵磷脂容易凝聚[11]，后来随着膜材比的逐渐增大，使得大豆卵磷脂的相对含量降低，包封率上升，并且在膜材比为4∶1时，达到了最大值，后来随着胆固醇的量增大到一定程度时，脂质体膜的亲水性较强，脂质体相互聚集使得膜易被破壞，包裹住的药物比较容易发生渗漏，导致包封率较低。
2.1.3 超声时间的影响 如图4所示，超声时间在25-40min的过程中，脂质体的包封率呈现1个上升的状态，且在超声时间为40min时达到最大值，可能是由于超声的有效时间过短，使脂质体不能均匀分散开来，脂质体相互聚集导致膜易破碎，药物流失严重，随着超声时间的逐渐加长，包封率呈现1个下降的趋势，应该是由于超声本身所具有的热效应导致的温度上升使得脂质体膜易被破坏[12]，还有可能就是超声时间过长，使得脂质氧化，药物渗漏，造成包封率下降。
2.1.4 水化温度的影响图 如图5所示，当温度由25℃逐渐上升到40℃时，包封率呈现1个明显的上升状态，且在40℃左右时，脂质体的稳定性较好，包封率较高;温度>40℃时，可能是由于温度过高加速了磷脂的氧化，药物的稳定性较差，使得脂质体膜易破碎，导致药物的流出。包封率下降[13]。
2.2 响应面法设计及结果
2.2.1 响应面优化实验结果 根据单因素实验，利用Box-Behnken实验设计原理，实验结果分析如表2所示。
在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken实验设计原理，选取药脂比，膜材比，超声时间和水化温度为自变量，红曲黄色素的包封率为响应值。利用软件Design Expert 8.0.6，对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到红曲黄色素包封率和实验变量A、B、C、D二次回归方程： Y=62.0+0.39A+1.20B-1.57C+3.79D-9.43A2-7.07B2-9.35C2-7.96D2
由表3显示，A、B、C、D 4个因素对该模型的影响作用大小为D>C>B>A，该回归模型较为显著（P=0.0003<0.01），模型失拟项P=0.3390>0.05，且失拟项不显著，说明该模型的建立和试验数据的模拟程度一般。并且在通过Box-behnken软件分析得到红曲黄色素脂质体制备的最佳工艺参数为超声提取时间36.8min，超声提取温度49.6℃，膜材比为4.32∶1，药脂比为1∶20.4。在最优提取条件下，红曲黄色素脂质体的包封率为62.572%。
3.2.2 等高线图和响应曲面图分析 如图6所示，当超声时间为36.8min，水化温度为49.6℃时，通过分析最佳工艺条件可以得出，当药脂比在1∶15～1∶20.4的区域范围内，膜材比在3∶1～4.32∶1的区域内脂质体的包封率随着膜材比和药脂比的变化而不断上升，但上升趋势较为缓慢，当药脂比为20.4∶1时，膜材比为4.32∶1时，脂质体的包封率达到最大值。
如图7所示，当超声时间为36.8min，膜材比为4.32∶1时，通过分析最佳工艺条件可以得出，当药脂比在1∶15～1∶20.4的区域范围内，水化温度在35℃～49.6℃的区域范围内，脂质体的包封率随着水化温度和药脂比的变化而不断上升，但上升趋势较为缓慢，当药脂比为20.4∶1时，水化温度为49.6℃时，脂质体的包封率达到最大值。
如图8所示，当超声时间为36.8min，膜材比为4.32∶1时，通过分析最佳工艺条件可以得出，当药脂比在1∶15～1∶20.4的区域范围内，水化温度在35℃～49.6℃的区域范围内，脂质体的包封率随着水化温度和药脂比的变化而不断上升，但上升趋势较为缓慢，当药脂比为20.4∶1时，水化温度为49.6时，脂质体的包封率达到最大值。
1.3.3 验证性实验 由表4可知，为验证模型可靠性，再用上述优化的最佳提取条件和考虑实际情况后，采用超声时间36.8min，水化温度41℃，药脂比为1∶20.4，膜材比为4.32∶1进行实验，实际验证包封率的平均值为61.4%，相对误差为1.8%。表明该模型能够真实反映出各因素对红曲黄色素脂质体包封率的影响，因此该回归模型具有一定的真实的可靠性。
2.3 抗氧化性试验 由图9可知，在反应时间为40min的情况下，红曲黄色素脂质体能够有效地抑制DPPH自由基的产生，随着加入的溶液体积越大，清除率就越大，同时在反应过程中应注意此反应全过程应在光线阴暗处进行。
3 结论
本实验采用薄膜分散法对红曲黄色素脂质体进行制备，以膜材比、药脂比、超声时间、水化温度为单因素进行实验，其中药脂比大小对脂质体的包封率影响最大，在此基础上进行了4因素3水平的Box-Behnken实验设计，得到红曲黄色素的最佳提取工艺为药脂比为1∶20.4，水化温度41.2℃，超声时间36.8min，膜材比为4.32∶1。在此提取条件下，预测红曲黄色素脂质体的包封率为62.572%，通过实际操作，选择水化温度为41℃，超声时间为36min，膜材比为4.3∶1，药脂比为1∶20进行实验，重复3次实验得到包封率為61.4%，相对误差1.8%，结果表明，实验模拟的拟合程度一般，说明预测的优化工艺合理，且根据DPPH的抗氧化试验结果可知，红曲黄色素脂质体的稳定较好。
参考文献
[1]张婵，杨强，张桦林，等.超声辅助法优化提取红曲黄红、红曲黄色素[J].食品与生物技术学报，2014，33（08）：805-813.
[2]周容，王奕芳，李良，等.红曲黄在酿酒行业中的应用进展[J].酿酒，2018，45（05）：23-28.
[3]米佳，禄璐，罗青，等.枸杞玉米黄素双棕榈酸酯脂质体的制备及其体外抗氧化活性[J].食品工业科技，2019，40（04）：195-199，20
[4]张斌.不同磷脂膜材对脂质体稳定性的影响[D].郑州：河南工业大学，2016.
[5]方晓旭.硬脂醇半乳糖苷修饰阿西替尼脂质体的制备及体外抗肝癌活性的初步研究[D].锦州：锦州医科大学，2017.
[6]张波.基于脂质纳米载体共递送奥沙利铂及伊立替康用于增强结直肠癌治疗的研究[D].济南：山东大学，2017.
[7]黄娟，姚若一，黄邵培，等.红曲黄霉产色素和桔霉素影响因素的研究进展[J].酿酒科技，2018（02）：109-112.
[8]夏鸿熙.VD3脂质体的制备及其体内外抑制光老化活性初步研究[D].长春：吉林大学，2017.
[9]钱敏，梁彬霞，白卫东，等.红曲色素提取及分离纯化研究[J].中国调味品，2012，37（03）：17-21.
[10]田菊霞，解宇，杨艳宏.薄膜分散-超声法制备BMPs磁性脂质体[J].健康研究，2012，32（01）：1-3.
[11]李然，陈璐，齐娟，等.南极冰藻DNA光修复酶脂质体的制备及其质量评价[J].化学与生物工程，2017，34（10）：25-31.
[12]周伟华.纳米脂质载体的制备与应用研究[D].长沙：中南大学，2008.
[13]谭强来，曾臻，武晓丽，等.几种果渣提取物抗氧化能力的比较研究[J].中国食物与营养，2019，25（04）：49-52.
（责编：杨 林）