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摘要：目的 观察果王素对小鼠肺腺癌移植瘤生长和转移的抑制作用，检测小鼠移植瘤肿瘤组织中NPM的表达，探讨果王素抑制肿瘤生长与转移可能的机制。方法 构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，将32只接种Lewis肺腺癌细胞的C57BL/6J小鼠随机分为对照组、低剂量（60mg/kg）果王素组、中剂量（120mg/kg）果王素组和高剂量（240mg/kg）果王素组，每组8只。接种后第4天起，予以相应药物干预，第24天处死小鼠，分离移植瘤称瘤体质量，计算转移抑制率与肿瘤抑制率，剖胸取肺组织观察肿瘤转移情况，免疫组化法检测小鼠皮下移植肿瘤细胞中NPM的表达水平。结果 果王素组小鼠皮下移植瘤的生长速度、体积、质量和肺转移结节数较对照组明显降低，而肿瘤抑制率和肺转移抑制率显著升高，皮下移植瘤中NPM蛋白表达水平下降。而且果王素的浓度越高，上述指标差异越明显，差异有统计学意义。结论 果王素对小鼠肺腺癌移植瘤的生长和转移有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过抑制NPM过表达，抑制肿瘤的生长与转移。
关键词： 果王素 小鼠 NPM 肺腺癌 轉移瘤
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）09-013-02
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，也是我国死亡率上升最快的癌症， [1-2]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌占80%-85%，肺腺癌最常见的非小细胞肺癌，大部分患者确诊时已为中晚期，丧失手术治疗机会[3]，放化疗为该类患者的标准治疗方案，但近年来其疗效已达到瓶颈，且副作用严重 [4]。因此寻找高效、低毒的天然药物抑制肿瘤的生长和转移是今后抗肿瘤的新策略之一。果王素（猕猴桃果仁油脂肪酸）具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等[5]。课题组前期研究表明[6-7]，果王素能有效抑制小鼠肺腺癌的生长和转移。但其具体的抗肿瘤机制尚不太明确。NPM（核仁磷酸蛋白）是一种核仁蛋白，在细胞增殖和生长中发挥重要作用[8-9]。有研究表明[10-13]，NPM在多种肿瘤组织中过表达，其表达水平与肿瘤发展阶段呈正相关。本研究通过构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，予以不同剂量的果王素进行干预，观察其对肺腺癌小鼠移植瘤生长和转移的作用，并检测肿瘤组织中NPM蛋白表达水平，探索其抗肿瘤的可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Lewis肺腺癌荷瘤种鼠（鼠源）2只，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。C57BL/6J 小鼠32只，雄性，体重（20±2）g，购于中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心，（许可证号：SYXK[京]2019-0019）。
1.1.2 药品及试剂 果王素购于湘西老爹生物有限公司，为黄色油性液体，中华猕猴桃果仁非饱和脂肪酸含量为600 g/L。兔抗鼠Nucleophosmin单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒、DAB显色剂由福建迈新生物技术开发公司提供。
1.2 动物模型的建立 处死Lewis 肺腺癌荷瘤种鼠，无菌条件下剥离肿瘤并去掉表面结缔组织、血管以及内部坏死组织，按1 g肿瘤组织加4ml 0.9% 氯化钠溶液的比例在表面皿中剪碎，置入匀浆机中研磨成匀浆液，用孔径 0.042 mm的360 目钢网滤过，制成肿瘤细胞悬液，倒入离心管，加入0.9% 氯化钠溶液，显微镜下将细胞密度调节为 2×106 个 /mL，在每只C57BL/6J 小鼠右后腿根部外侧皮下注射 0.2 mL 的肿瘤细胞悬液，建立肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。
1.3实验分组及用药 所有小鼠接种肿瘤细胞后第4天，皮下移植处均见小结节样肿瘤生长，开始予以药物干预。按随机数字表法将32只小鼠分为4组，每组8只，对照组、低剂量（60mg/kg）果王素处理组、中剂量（120mg/kg）果王素处理组和高剂量（240mg/kg）果王素处理组，剂量依据课题组前期工作及相关文献而定[6-7]。对照组小鼠给0.9% 氯化钠溶液0.3 mL灌胃，果王素处理组小鼠分别以0.3ml用0.9% 氯化钠溶液稀释（60、120、240）mg/kg果王素的液体灌胃，每天一次。肿瘤接种后第24天处死全部小鼠，取出皮下移植瘤，固定于4%中性甲醛溶液，后包埋于石蜡，以供免疫组织化学染色检测。剖胸取双肺组织置入Boins液固定，用以观察肺表面转移结节数。
1.4 观察指标和方法
1.4.1 肿瘤生长与转移的观测 小鼠接种肿瘤细胞第4天起，每3天测量皮下移植瘤最大长径a和短径b一次，计算肿瘤体，肿瘤平均体积=0.52a×b2。实验结束后，分离移植瘤，称肿瘤重量，计算肿瘤抑制率（%）=（1-果王素处理组瘤体质量/对照组瘤体质量）×100%。剖胸取双肺组织，置入Boins液处理后，对肺表面的转移结节进行拍照并计数，计算肺转移抑制率（%）=（1-果王素处理组平均转移结节数/对照组平均转移结节数）×100%。
1.4.2 免疫组织化学法检测 用免疫组织化学S-P法检测NPM的表达，方法及步骤严格按试剂盒说明书进行，一抗为兔抗鼠Nucleophosmin单克隆抗体，抗体按1：100稀释，用PBS缓冲液替代一抗为阴性对照。NPM染色结果判定标准：细胞核中出现清晰棕黄色或棕褐色颗粒清晰为阳性。采用全自动图像分析系统测定肿瘤组织中NPM的平均灰度值。
1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0软件对所有实验数据进行统计学处理，定量数据以 表示，采用X2检验、单因素方差分析、q检验分别比较率、多组间均数、两两间均数，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1果王素抑制小鼠移植瘤的生长和转移
接种肿瘤细胞后，皮下移植处成瘤率100.0%，接种后的前4天，各组小鼠皮下移植瘤大小无明显差异，后逐渐增大，局部呈结节状，接种第18～24天后，各剂量果王素处理组小鼠皮下移植瘤生长明显慢于对照组，且高剂量果王素组肿瘤生长最，接种肿瘤细胞后第24天，各组小鼠均存活。处死小鼠后解剖观察见各剂量果王素处理组对皮下移植瘤生长及肿瘤肺转移均有明显抑制作用（图 1、2）。与对照组相比，各剂量果王素处理组皮下肿瘤的体积、質量和肺表面转移结节数均明显降低（P<0.05， P<0.01），而肿瘤抑制率和肺表面结节转移抑制率均明显升高（P<0.05， P<0.01），与低果王素处理组比较，中高果王素处理组上述指标显著改善（P<0.05， P<0.01），而且，高果王素处理组上述指标较中果王素处理组改善更明显（P<0.05），表 1。
2.2果王素下调小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白的表达
NPM蛋白表达与肿瘤细胞胞核中，出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。对照组出现较多NPM阳性细胞，低、中、高剂量果王素处理组均仍有少量阳性细胞，而且随着果王素剂量升高，NPM表达依次减少，各组之间相比差异均有统计学意义（P<0.01，图3）。
3、讨论
肺癌恶性程度高，易出现远处转移，预后较差。肺癌的发生发展受多因素影响，与多种癌基因过度表达及抑癌基因的失活密切相关。近年来，靶向治疗开创了肺癌治疗新时代。果王素为猕猴桃果仁静临界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分为a-亚麻酸，含有一定量的维生索E及微量元素硒等物质，具有抗癌和保护正常组织细胞活性的作用。课题组前期研究表明[6-7，14]，果王素度肺腺癌的生长与转移有较好的抑制作用。本研究发现，与对照组相比，各剂量果王素组小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生长速度、质量和肺转移结节数明显降低，而肿瘤抑制率和肺转移抑制率则明显升高，并且随着果王素处理剂量的效果越显著，各组间相比均有统计学意义。结果表明果王素能明显抑制肺腺癌移植瘤的生长与转移，且呈剂量依赖性。
另外，本研究通过检查小鼠肺腺癌移植瘤内NPM的表达情况，为了进一步探讨果王素是否通过调控NPM表达发挥抑制肺腺癌的生长与转移作用。NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，能在核仁、核质核胞质之间穿梭，具有多种功能，不仅与核糖体生物合成[15]、DNA复制和修复[16]、调节抑癌基因p53和p14的活性[17]、作为分子伴侣阻止蛋白集聚等过程密切相关，而且参与监控核仁活性及细胞增殖。本研究中，对照组中NPM蛋白呈高表达，而果王素理组NPM蛋白的表达及平均灰度值随剂量递增依次降低，且高剂量果王素处理组下降最明显。结果表明，果王素可能通过抑制肿瘤组织中NPM蛋白过表达发挥抑制肺腺癌生长和转移的作用。
综上所述，果王素能明显抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长和转移，其作用机制可能与抑制NPM蛋白的过表达有关。NPM在肺癌的发生发展中起癌基因作用，有可能成为肺癌靶向治疗的潜在靶点。但肺癌的发病机制非常复杂，果王素抑制肺癌生长和转移的作用机理仍有待更更一步探索。
参考文献：
[1]Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.
[2]Cao M， Chen W. Epidemiology of lung cancer in China[J].Thorac Cancer， 2019， 10（1）：3-7.
[3]Rosell R， Karachaliou N. Large-scale screening for somatic mutations in lung cancer [J]. Lancet， 2016，387：1354-1356.
[4]Hsu WH， Yang JC， Mok TS， et al.Overview of current systemic management of EGFR-mutant NSCLC[J]. Ann Oncol，2018，29：13-19.
[5]Liu L， Qian H， Yin H， et al. Unsaturated Fatty Acid of Actinidia Chinesis Planch Seed Oil Enhances the Antioxidative Stress Ability of Rats With Pulmonary Fibrosis Through Activating Keap1/Nrf2 Signaling Pathway[J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi， 2016， 32 （4）： 479-483.
[6]贺兼斌，易高众，向志，等.果王素对肺腺癌小鼠移植瘤转移的抑制作用及机制[J].实用肿瘤杂志，2014，29（6）：527-532.
[7]刘理静，周美玲，陈智魁，贺兼斌.中华猕猴桃果仁油非饱和脂肪酸（果王素）上调含EH结构域蛋白2（EH2）抑制肺腺癌小鼠移植瘤生长和转移[J].细胞和分子免疫学杂志，2020，（07）：622-627.
[8]李祺福，石松林，刘庆榕， 等.人参皂甙R91组合诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中Nucleophosmin的表达与定位变化[J]. 细胞生物学杂志，2008，30（7）： 265-272.
关键词： 果王素 小鼠 NPM 肺腺癌 轉移瘤
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）09-013-02
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，也是我国死亡率上升最快的癌症， [1-2]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌占80%-85%，肺腺癌最常见的非小细胞肺癌，大部分患者确诊时已为中晚期，丧失手术治疗机会[3]，放化疗为该类患者的标准治疗方案，但近年来其疗效已达到瓶颈，且副作用严重 [4]。因此寻找高效、低毒的天然药物抑制肿瘤的生长和转移是今后抗肿瘤的新策略之一。果王素（猕猴桃果仁油脂肪酸）具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等[5]。课题组前期研究表明[6-7]，果王素能有效抑制小鼠肺腺癌的生长和转移。但其具体的抗肿瘤机制尚不太明确。NPM（核仁磷酸蛋白）是一种核仁蛋白，在细胞增殖和生长中发挥重要作用[8-9]。有研究表明[10-13]，NPM在多种肿瘤组织中过表达，其表达水平与肿瘤发展阶段呈正相关。本研究通过构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，予以不同剂量的果王素进行干预，观察其对肺腺癌小鼠移植瘤生长和转移的作用，并检测肿瘤组织中NPM蛋白表达水平，探索其抗肿瘤的可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Lewis肺腺癌荷瘤种鼠（鼠源）2只，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。C57BL/6J 小鼠32只，雄性，体重（20±2）g，购于中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心，（许可证号：SYXK[京]2019-0019）。
1.1.2 药品及试剂 果王素购于湘西老爹生物有限公司，为黄色油性液体，中华猕猴桃果仁非饱和脂肪酸含量为600 g/L。兔抗鼠Nucleophosmin单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒、DAB显色剂由福建迈新生物技术开发公司提供。
1.2 动物模型的建立 处死Lewis 肺腺癌荷瘤种鼠，无菌条件下剥离肿瘤并去掉表面结缔组织、血管以及内部坏死组织，按1 g肿瘤组织加4ml 0.9% 氯化钠溶液的比例在表面皿中剪碎，置入匀浆机中研磨成匀浆液，用孔径 0.042 mm的360 目钢网滤过，制成肿瘤细胞悬液，倒入离心管，加入0.9% 氯化钠溶液，显微镜下将细胞密度调节为 2×106 个 /mL，在每只C57BL/6J 小鼠右后腿根部外侧皮下注射 0.2 mL 的肿瘤细胞悬液，建立肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。
1.3实验分组及用药 所有小鼠接种肿瘤细胞后第4天，皮下移植处均见小结节样肿瘤生长，开始予以药物干预。按随机数字表法将32只小鼠分为4组，每组8只，对照组、低剂量（60mg/kg）果王素处理组、中剂量（120mg/kg）果王素处理组和高剂量（240mg/kg）果王素处理组，剂量依据课题组前期工作及相关文献而定[6-7]。对照组小鼠给0.9% 氯化钠溶液0.3 mL灌胃，果王素处理组小鼠分别以0.3ml用0.9% 氯化钠溶液稀释（60、120、240）mg/kg果王素的液体灌胃，每天一次。肿瘤接种后第24天处死全部小鼠，取出皮下移植瘤，固定于4%中性甲醛溶液，后包埋于石蜡，以供免疫组织化学染色检测。剖胸取双肺组织置入Boins液固定，用以观察肺表面转移结节数。
1.4 观察指标和方法
1.4.1 肿瘤生长与转移的观测 小鼠接种肿瘤细胞第4天起，每3天测量皮下移植瘤最大长径a和短径b一次，计算肿瘤体，肿瘤平均体积=0.52a×b2。实验结束后，分离移植瘤，称肿瘤重量，计算肿瘤抑制率（%）=（1-果王素处理组瘤体质量/对照组瘤体质量）×100%。剖胸取双肺组织，置入Boins液处理后，对肺表面的转移结节进行拍照并计数，计算肺转移抑制率（%）=（1-果王素处理组平均转移结节数/对照组平均转移结节数）×100%。
1.4.2 免疫组织化学法检测 用免疫组织化学S-P法检测NPM的表达，方法及步骤严格按试剂盒说明书进行，一抗为兔抗鼠Nucleophosmin单克隆抗体，抗体按1：100稀释，用PBS缓冲液替代一抗为阴性对照。NPM染色结果判定标准：细胞核中出现清晰棕黄色或棕褐色颗粒清晰为阳性。采用全自动图像分析系统测定肿瘤组织中NPM的平均灰度值。
1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0软件对所有实验数据进行统计学处理，定量数据以 表示，采用X2检验、单因素方差分析、q检验分别比较率、多组间均数、两两间均数，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1果王素抑制小鼠移植瘤的生长和转移
接种肿瘤细胞后，皮下移植处成瘤率100.0%，接种后的前4天，各组小鼠皮下移植瘤大小无明显差异，后逐渐增大，局部呈结节状，接种第18～24天后，各剂量果王素处理组小鼠皮下移植瘤生长明显慢于对照组，且高剂量果王素组肿瘤生长最，接种肿瘤细胞后第24天，各组小鼠均存活。处死小鼠后解剖观察见各剂量果王素处理组对皮下移植瘤生长及肿瘤肺转移均有明显抑制作用（图 1、2）。与对照组相比，各剂量果王素处理组皮下肿瘤的体积、質量和肺表面转移结节数均明显降低（P<0.05， P<0.01），而肿瘤抑制率和肺表面结节转移抑制率均明显升高（P<0.05， P<0.01），与低果王素处理组比较，中高果王素处理组上述指标显著改善（P<0.05， P<0.01），而且，高果王素处理组上述指标较中果王素处理组改善更明显（P<0.05），表 1。
2.2果王素下调小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白的表达
NPM蛋白表达与肿瘤细胞胞核中，出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。对照组出现较多NPM阳性细胞，低、中、高剂量果王素处理组均仍有少量阳性细胞，而且随着果王素剂量升高，NPM表达依次减少，各组之间相比差异均有统计学意义（P<0.01，图3）。
3、讨论
肺癌恶性程度高，易出现远处转移，预后较差。肺癌的发生发展受多因素影响，与多种癌基因过度表达及抑癌基因的失活密切相关。近年来，靶向治疗开创了肺癌治疗新时代。果王素为猕猴桃果仁静临界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分为a-亚麻酸，含有一定量的维生索E及微量元素硒等物质，具有抗癌和保护正常组织细胞活性的作用。课题组前期研究表明[6-7，14]，果王素度肺腺癌的生长与转移有较好的抑制作用。本研究发现，与对照组相比，各剂量果王素组小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生长速度、质量和肺转移结节数明显降低，而肿瘤抑制率和肺转移抑制率则明显升高，并且随着果王素处理剂量的效果越显著，各组间相比均有统计学意义。结果表明果王素能明显抑制肺腺癌移植瘤的生长与转移，且呈剂量依赖性。
另外，本研究通过检查小鼠肺腺癌移植瘤内NPM的表达情况，为了进一步探讨果王素是否通过调控NPM表达发挥抑制肺腺癌的生长与转移作用。NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，能在核仁、核质核胞质之间穿梭，具有多种功能，不仅与核糖体生物合成[15]、DNA复制和修复[16]、调节抑癌基因p53和p14的活性[17]、作为分子伴侣阻止蛋白集聚等过程密切相关，而且参与监控核仁活性及细胞增殖。本研究中，对照组中NPM蛋白呈高表达，而果王素理组NPM蛋白的表达及平均灰度值随剂量递增依次降低，且高剂量果王素处理组下降最明显。结果表明，果王素可能通过抑制肿瘤组织中NPM蛋白过表达发挥抑制肺腺癌生长和转移的作用。
综上所述，果王素能明显抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长和转移，其作用机制可能与抑制NPM蛋白的过表达有关。NPM在肺癌的发生发展中起癌基因作用，有可能成为肺癌靶向治疗的潜在靶点。但肺癌的发病机制非常复杂，果王素抑制肺癌生长和转移的作用机理仍有待更更一步探索。
参考文献：
[1]Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.
[2]Cao M， Chen W. Epidemiology of lung cancer in China[J].Thorac Cancer， 2019， 10（1）：3-7.
[3]Rosell R， Karachaliou N. Large-scale screening for somatic mutations in lung cancer [J]. Lancet， 2016，387：1354-1356.
[4]Hsu WH， Yang JC， Mok TS， et al.Overview of current systemic management of EGFR-mutant NSCLC[J]. Ann Oncol，2018，29：13-19.
[5]Liu L， Qian H， Yin H， et al. Unsaturated Fatty Acid of Actinidia Chinesis Planch Seed Oil Enhances the Antioxidative Stress Ability of Rats With Pulmonary Fibrosis Through Activating Keap1/Nrf2 Signaling Pathway[J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi， 2016， 32 （4）： 479-483.
[6]贺兼斌，易高众，向志，等.果王素对肺腺癌小鼠移植瘤转移的抑制作用及机制[J].实用肿瘤杂志，2014，29（6）：527-532.
[7]刘理静，周美玲，陈智魁，贺兼斌.中华猕猴桃果仁油非饱和脂肪酸（果王素）上调含EH结构域蛋白2（EH2）抑制肺腺癌小鼠移植瘤生长和转移[J].细胞和分子免疫学杂志，2020，（07）：622-627.
[8]李祺福，石松林，刘庆榕， 等.人参皂甙R91组合诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中Nucleophosmin的表达与定位变化[J]. 细胞生物学杂志，2008，30（7）： 265-272.